Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

Resumo

Neste trabalho, explicar a fabricação ea utilização de um misturador microfluídico capaz de mistura de duas soluções em ~ 8 mS. Nós também demonstrar a utilização destes misturadores com detecção de fluorescência utilizando espectroscopia de UV e de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

Resumo

O processo pelo qual um dobras de proteínas em sua conformação nativa é altamente relevante para a biologia e saúde humana mas ainda pouco compreendido. Uma razão para isso é que a dobragem tem lugar durante um vasta gama de escalas de tempo, a partir de nanosegundos em segundos ou mais, dependendo da proteína ^1. Convencionais stopped-flow misturadores têm permitido a medição da cinética de dobragem a partir de cerca de 1 ms. Recentemente, desenvolvemos um misturador de microfluídica que dilui desnaturante ~ 100 vezes em ~ 8 mS ^2. Ao contrário de um misturador de stopped-flow, este misturador opera no regime de fluxo laminar em que a turbulência não ocorre. A ausência de turbulência permite simulação numérica precisa de todos os fluxos dentro do misturador com excelente concordância para experimentar ^3-4.

O fluxo laminar é conseguida por números de Reynolds Re ≤ 100. Para soluções aquosas, isto requer geometrias escala mícron. Nós usamos um substrato duro, tal como silício ou sili fundidaca, para fazer canais iM 5-10 de largura e 10 uM de profundidade (ver Figura 1). As menores dimensões, na entrada para a região de mistura, são da ordem de 1 mícron de tamanho. O chip é selado com um fino ou de vidro de sílica fundida lamela para o acesso óptico. Típicos totais taxas de fluxo linear são ~ 1 m / s, Re rendendo ~ 10, mas o consumo de proteínas é apenas ~ 0,5 nL / s ou 1,8 uL / hr. A concentração de proteína depende do método de detecção: Para triptofano fluorescência a concentração típica é de 100 uM (para 1 Trp / proteína) e para FRET a concentração típica é de ~ 100 nM.

O processo de dobragem é iniciada por diluição rápida de desnaturante a partir de 6 M a 0,06 M de hidrocloreto de guanidina. A proteína em desnaturante alta flui para baixo de um canal central e está reuniu-se em ambos os lados na região de mistura por tampão sem desnaturante movendo ~ 100 vezes mais rápido (ver Figura 2). Esta geometria faz com que a constrição do fluxo rápido de proteína em uma estreitajet ~ 100 nm de largura. A difusão das moléculas de luz desnaturantes é muito rápida, enquanto que a difusão das moléculas de proteína pesados ​​é muito mais lenta, difundindo menos do que 1 mícron de 1 ms. A diferença de difusão constante do desnaturante e os resultados de proteína em diluição rápida do desnaturante a partir do fluxo de proteínas, reduzindo a concentração eficaz do desnaturante em torno da proteína. O jacto de proteína flui a uma taxa constante para baixo o canal de observação e de fluorescência da proteína durante a dobragem pode ser observada usando um microscópio confocal de varredura ^5.

Protocolo

1. Fabricação de chips microfluídicos mistura

A Figura 3 mostra os passos de fabricação de base.

1. Limpar 4 polegadas (100 mm) bolachas de sílica fundida com uma solução de Piranha fresco (3:1 H ₂ SO _4: H2O _2): i) aquece-se a ácido sulfúrico a 130 ° C e depois junta-o peróxido. Note-se que a rugosidade da superfície e da planeza das bolachas de sílica fundida utilizado desempenhar um papel importante para a etapa de ligação final. ii) Mergulhar as bolachas durante pelo menos 30 minutos. iii) Lavar durante 5 minutos com água e seco. Aplicar um revestimento de polissilício (poli), ~ 1 mm de espessura por cada microns de dimensão destina 10 dos canais finais microfluídicos, usando uma baixa pressão de deposição química de vapor (LPCVD) da fornalha.
2. Limpe as bolachas e máscara usando o protocolo Piranha no passo 1.1. Limpar a máscara da mesma forma e lavar com metanol, acetona e isopropanol e secar com ar imediatamente. Desidratar as bolachas sobre uma placa quente a 150 ° C durante ~ 10 minutos (utilizar uma tenda de folha de alumínio para manter as partículas de distância) ou num forno de 120 ° C durante pelo menos 120 min (durante a noite, de preferência). Para aumentar a adesão da fotorresiste, imediatamente expor as bolachas quentes para HMDS vapor durante 5 minutos. Revestimento de spin as bolachas com uma camada nm ~ 900 espessa de material fotosensitivo AZ5214 e cozer mole a 90 ° C directamente numa placa de aquecimento durante 1 minuto ou num forno a 110 ° C durante 30 min (Figura 3, passo 1).
3. Alinhar a máscara e fazer um contacto rígido e de vácuo. Expor à luz UV durante vários segundos (total de energia: ~ 103 mJ / cm ²⁾ (Figura 3, passo 2). Desenvolver com AZ400K desenvolvedor, diluído 4:1 com água DI para ~ 50 segundos (até fotorresiste está completamente desenvolvido), enquanto suavemente agitando. Lavar com água por 2 minutos. Inspeccionar características com microscópio (Figura 3, passo 3). Se os recursos são mal resolvido, tira o fotorresiste e começar de novo de 1,2. Difícil assar 115 ° C diretamente sobre uma placa para 2minutos.
4. Wafers Descum com plasma ₂ Asher ou O para 2,5 minutos a 100 W de potência de RF. Usando uma profunda reativa iônica etcher (DRIE), a camada de polisilício etch todo o caminho até a sílica fundida abaixo. Descascar o material fotosensitivo restante com PRS2000 resistir extractor, a 75 ° C durante 10 minutos. Lavar e secar. Meça a profundidade etch para garantir que é todo o caminho através do revestimento de poli (Figura 3, o passo 4).
5. Usando um DRIE óxido capaz tais como um etcher ULVAC NLD-6000, sílica fundida etch a uma profundidade de ~ 10 mM por espessura do revestimento micron poli (Figura 3, o passo 5). Este revestimento de poli será usada fora durante o ataque, de modo que pode ser necessário para verificar a integridade do revestimento periodicamente durante o processo de gravação. Se as regiões intencionalmente traços característicos da superfície bolacha tornaram-se despida do revestimento protector poli durante decapagem, a superfície tem tornar-se mais provável pitted e não será mais adequado para a ligaçãonas etapas finais de produção. Neste caso, a bolacha é mais provável já não viável. Limpe com o Asher Matrix por 4 minutos, 100 W de potência de RF. Descascar o polissilício com um ₂ XeF etcher (Figura 3, etapa 6). Pode ser necessário repetir o passo de 1,4 e este passo algumas vezes para remover todos os revestimentos de resina fotossensível e poli.
6. Girar bolachas revestimento com uma nova camada uM ~ 1 de material fotosensitivo para proteger os canais durante o manuseamento subsequente. Perfurar orifícios de entrada e saída em cada chip utilizando um computador controlado com ponta de diamante broca ou manualmente com um jacto de areia (Figura 3, passo 7). Se estiver usando uma furadeira, montar o wafer (característica voltada para baixo) em uma placa de vidro usando sacrificial do Aqua de Bond 55, tendo o cuidado de manter o bonder livre de bolhas. Esfriar a broca com micro-90 solução de limpeza. Isto mantém pequenos pedaços de vidro se colem aos canais que, em seguida, entupir o chip durante o uso.
7. Lavar a bolacha com água Dl usando uma seringa para injectar wAter em cada buraco. Mergulhe em água com sabão durante uma hora. Remover fotorresiste e Bond Aqua com PRS 2000 a 60 ° C por várias horas até que a superfície esteja limpa. Enxágüe com água DI bolacha e água morna e sabão. Lavar cada buraco de novo com uma seringa, evitando características gravadas. Bolacha seco com azoto e num forno de vácuo ajustado para 120 ° C. Inspecione buracos para garantir que eles estão livres de grão e repita os passos de limpeza, se necessário. Medir a profundidade dos canais com qualquer um perfilador superfície uma óptico ou mecânico (Figura 3, o passo 8).
8. Bolachas limpas e um número equivalente de 170 mm de espessura vidros de cobertura de sílica fundida com 1) solução Piranha (1-2 horas de acordo com o procedimento descrito em 1.1), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: H ₂ 0 ₂ ) solução durante 10 minutos a 75 C, 3) RCA 1 de solução (05:01:01 _DI: NH4OH: H ₂ 0 ₂₎ durante 22 minutos a 75C). Enxágüe com água DI por 5 minutos entre cada solução.
9. Características Coloque um wafer lado em cima deuma pilha de toalhetes de salas limpas 3-4 colocados no topo de uma superfície plana, como um pequeno painel de vidro. Seca-se a bolacha cuidadosamente com gás azoto durante pelo menos 5 minutos. Repita com tampa de vidro. Pegue tampa de vidro pela extremidade e inverter tal que o lado polido é realizada a face para baixo sobre a bolacha e alinhar as bordas planas. Com cuidado, solte a tampa de vidro sobre a bolacha e deixe repousar. Deslocar horizontalmente apenas para ajustar o alinhamento. Empurrar para baixo com um dedo sobre o centro da bolacha. Deve-se ver uma frente de ligação começar a irradiar para fora. Se necessário, aplicar uma pressão adicional para outras posições em torno da bolacha para fazer avançar a frente de ligação (Figura 3, passo 9).
10. Colocar as bolachas seladas em um forno de alta temperatura definida para a rampa de temperatura ambiente a 800 ° C durante 3 horas, em seguida, 800-1100 ° C ao longo de mais 1,2 horas. Mantenha a 1100 ° C durante 2 horas e, em seguida rampa até à temperatura ambiente ao longo de mais 1,5 horas.
11. Dice com uma bolacha cortar viu em ifichas ndividual (Figura 3, passo 10).
12. O protocolo descreve a fabricação de canais no substrato de sílica fundida bastante incomum que é necessário para a detecção de UV. Mas este protocolo pode também ser adaptado para um substrato de silício que requer apenas um passo de erosão um ^2. Um copo (mas não de sílica fundida) de vidro de cobertura pode ser ligada à bolacha utilizando ligação anódica.

2. Montagem e carregar chips

1. O colector para segurar o chip de mistura e soluções podem ser feitos de plástico, tal como Lexan ou plexiglas, ou de alumínio para controlo da temperatura (ver Figura 4). Se usando alumínio, os reservatórios solução deve ser revestida com parileno para impedir a dissolução de alumínio, as soluções salinas nos reservatórios. A temperatura do colector de todo, as soluções e chip pode ser controlada com dispositivos termoeléctricos montado sobre os lados e um controlador electrónico.
2. O chip é acoplado à manidobra por pequenas O-rings e uma mantido no lugar com um anel de retenção que permite uma visão clara óptica do centro do chip. Os sulcos o-ring deve ser menos profundo do padrão para garantir uma boa acasalamento sem aplicação de pressão demasiado para o chip, isto é, um O-ring 002 deve ser 0,025 "de profundidade. Uma vez que o chip é montado, adicionar soluções para os reservatórios de centro e lado , tendo o cuidado para libertar quaisquer bolhas presas na parte inferior dos poços.
3. Como os volumes utilizados neste misturador são tão pequenas, o fluxo pode ser controlada com a pressão do ar aplicada acima dos poços de solução. A Figura 4 mostra o colector de pressão acoplado a parte superior do colector de chip por O-rings. O colector de pressão está ligada a transdutores de pressão controladas por computador que pode manter a pressão de ~ 2-80 PSI. O chip foi concebido de modo tal que as pressões iguais sobre os canais central e lateral produzir uma relação de ~ 100 vezes nas taxas de fluxo linear. A 20 psi, a taxa de fluxo linear no canal de saída é de ~ 1 m/ S.
4. Coloque colector em um microscópio invertido e examinar a mistura região com a ocular ou a saída da câmara. Uma lanterna incandescente colocado no topo do colector irá fornecer luz suficiente. Utilizar um índice elevado de corante ou solução de refracção (isto é, 6 M de cloridrato de guanidina) no canal central para visualizar do jacto.
5. Na pressão igual nos canais centrais e laterais, o jato será difícil ver a olho assim que começar com a pressão no lado do canal 0 PSI e aumentar lentamente a pressão igual. Se um canal lateral está obstruído, o jacto vai ser empurrado contra uma das paredes do canal de saída. Se uma obstrução visível aparece, pode ser desalojado por aplicação de pressão ou de vácuo para o canal de saída, com uma seringa.
6. Se a proteína ou outro material orgânico entope o chip, ele pode ser limpo por imersão em solução de Pirhana durante a noite.

3. Coleta de Dados

A Figura 5 mostra a disposição básica instrumento óptico.

1. Traga um feixe de laser colimado em um microscópio de grau de pesquisa utilizando um espelho dicróico dentro ou fora do microscópio. Alinhar o laser de modo que o foco pode ser visto na ocular ou câmara pouco perto da região de mistura.
2. Fluorescência a partir da proteína no misturador é recolhido por o objectivo e enviado através do espelho dicróico, focada por uma lente para um furo de pino e fotografada em um contador de fotões. Digitalizar o chip usando um scanner piezoelétrico em x e y para a imagem da região de mistura (tamanho do passo típico é de 2 mm). Escolha uma posição sobre a jacto e de verificação em X e Z para encontrar o foco no centro do canal de verticalmente. A profundidade de campo do microscópio é muito menos do que a profundidade do canal ea taxa de fluxo é uniforme no canal, excepto no interior 1 mícron das paredes. Por conseguinte, a resolução temporal da fluorescência observada é determinada principalmente pelo tamanho da mancha confocal.
3. Digitalizar horizontalmente dentro do canal de saída (típica passo size é 0,2 m em toda a jato, 2 micra ao longo da JET), em incrementos de 100 mM ao longo do jato, observando a posição ms ~ 1 por (ver Figura 6). Mova o estágio do microscópio por 80-90 mM ao longo do jato para capturar momentos posteriores.
4. Alternativamente, a luz pode ser detectada por um espectrógrafo e CCD após o espelho dicróico usando uma lente para focar a luz sobre a fenda de entrada. Uma vez que a recolha de dados é mais lento do que para o contador de fotões (1 segundo por posição), tipicamente o jacto é imaginado primeiro com o contador de fotões e, em seguida, os pontos ao longo do jacto são medidos com o espectrógrafo (ver Figura 7).
5. Os dados do contador de fotões é analisado pela soma 3-5 pixels em torno do jacto em cada posição para criar uma trama de intensidade versus distância. Tempo é calculado a partir distância usando uma velocidade calculado com base nas pressões aplicadas (ver Figura 8).
6. Os dados do espectrógrafo pode ser analisado um par de maneiras. Para FRET, channelersls designados como "doador" e "receptor" cada um pode ser resumida a relação de proximidade e E = I _A / (I + _D I _D) calculado (ver Figura 9). Alternativamente, a decomposição único valor pode ser realizada para examinar os componentes espectrais independentes em função do tempo, tais como a mudança no espectro de emissão do triptofano como um pregas de proteína.
7. Distância dentro do canal de saída pode ser convertido para o tempo usando a taxa de fluxo constante determinada a partir da pressão aplicada aos canais laterais. Dentro dos primeiros 2 mM de o canal de saída, a taxa de fluxo do jacto de proteína acelera ~ 100x e os tempos em que região deve ser calculada com a análise de elemento finito da simplifica (produzindo os tempos representada na Figura 8). Esta aceleração produz um deslocamento de aproximadamente 1-2 mS depois a velocidade se torna constante e geralmente pode ser ignorado na medição cinética muito mais lenta do que a mistura.

4. Os resultados representativos

A Figura 6 mostra um traçado de contorno da intensidade na região de mistura medido pelo contador de fotões. O fundo do canal de saída para fora do jacto deve ser próximo do piso de ruído do detector e tipicamente não é subtraído. Uma maior fundo pode indicar mau alinhamento ou que a proteína é adira às paredes do canal. Um jato que olha torto ou cortado, especialmente perto da região de mistura, indica um etch pobres dos bicos.

A Figura 7 mostra o tempo resolvido espectros a partir da proteína proteína acil-coenzima A-binding (ACBP) marcado com Alexa 488 e Alexa 647. Estes dados foram subtraídos de fundo para remover a carga escuro e sinal de laser. O sinal de fundo foi tirada com a pressão do canal central definido para 0 PSI.

O tempo de mistura pode ser medida por medição de uma reacção rápida que é muito mais rápido do que a mistura como a extinção de fluorescência Trp by KI ou colapso de DNA de cadeia simples, marcado com FRET corantes, por adição de NaCl. Porque o jacto é menor do que a resolução óptica do microscópio, existe uma queda de intensidade grande na região de mistura como as formas de jacto. Esta resposta do instrumento pode ser removido através de uma medição de controlo no qual nenhuma solução mudança condições. A Figura 8 mostra a razão de mistura (em 400 mM de KI) e não-mistura experiências de N-acetil amida de fluorescência de triptofano. A linha mostra a concentração prevista de KI a partir de simulações COMSOL. O tempo de mistura, tal como medido como o tempo para a concentração para diminuir de 80%, é de 8 mS.

Como os dados são coletados em incrementos de 100 mM ao longo do canal de saída 500 m de comprimento, os dados devem ser coladas a partir de múltiplas visões. Há deslocamentos ocasionalmente pequenas em sinal entre estes pontos de vista, provavelmente devido a pequenas alterações no foco como o chip é movido por platina do microscópio. Ao mover o estágio 80 ou 90mM por ponto de vista, esses deslocamentos podem ser eliminados através da análise de dados sobrepostas. Tipicamente os dados são recolhidos com pelo menos duas taxas de fluxo e os dados são combinados para confirmar quaisquer alterações de sinal são devidos a alterações reais espectroscópicos da proteína, em vez de efeitos ópticos ou de fluxo. Figura 9 mostra a FRET alterações na ACBP proteína após a diluição de desnaturante a partir de 6 M a 0,06 M. Esta dados não necessita de uma experiência de controlo desde a FRET é já uma proporção ea resposta do instrumento está já removido. O salto rápido perto de T = 0 representa uma mudança rápida em FRET sinal dentro do tempo de mistura.

Figura 1. Layout da região de mistura medidos por microscopia eletrônica.

Figura 2. Esquemático de hidrodinâmico mistura para estudar dobragem de proteína. A proteína,dissolvido em desnaturante de alta para desdobrá-lo, desce o canal central para a região de mistura onde se encontra com buffer de fluxo de aproximadamente 100 vezes mais rápido. O fluxo laminar força o fluxo de proteína num jacto estreito a partir do qual as moléculas de desnaturantes pode rapidamente difundir. À medida que o jacto flui para baixo o canal de saída, a proteína pode ser observado com a resolução espacial e temporal elevada utilizando um microscópio confocal.

Figura 3. Fabricação de sílica fundida. 1) O processo começa com um substrato de sílica altamente polido 500 mm de espessura fundida (a) com uma camada de polisilício (poli) depositados sobre as superfícies superior e inferior (b) e spin-revestido com uma camada de material fotosensitivo (c). 2) Um fotomáscara (e) é trazido int o contato rígido com a bolacha e o fotorresiste é exposto à luz UV (d). 3) A bolacha é colocado num banho de revelador e do padrão é revelado no material fotosensitivo. 4) A bolacha é colocado em um DRIE e as características são gravadas no revestimento de topo de poli. O material fotosensitivo é então removida. 5) A poli então actua como uma máscara quando a bolacha é colocado em um etcher óxido e as características são gravados 10-40 uM para o substrato de sílica fundida. 6) O revestimento de poli é então removido num ₂ XeF etcher. 7) A bolacha é ligado a uma placa de vidro de sacrifício com um selante activado por calor (g), com o lado características para baixo, e uma broca de diamante (f) abrasivamente brocas furos de passagem a partir da parte traseira. 8) Um profiler superfície (h), em seguida, mede diretamente as profundezas de recursos gravados. 9) uma 170 iM bolacha lamela de espessura de sílica fundida é ligado directamente sobre a superfície superior da bolacha. 10) O wafer é cortado em chips microfluídicos individuais.

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Figura 4. O colector de misturador. O microfluídico-chip é fixado ao colector de solução com uma placa de alumínio maquinado e quatro anéis sob as ~ 200 reservatórios uL. Um grande orifício é maquinada através do centro do colector directamente acima da região de mistura do afixada-chip microfluídico, permitindo que a luz UV em excesso para escapar sem retroespalhamento, inibindo qualquer autofluorescência a partir do colector de si e permitindo que a iluminação directa do chip pelo olho ou da câmera para o alinhamento. Os vedantes de ar múltiplas cada um dos reservatórios de tal forma que a pressão de ar em cada um pode ser controlada através de uma caixa externa de controlo de pressão.

Figura 5. Esquemática do microscópio confocal óptico.

Figura 6. Gráfico de contorno de triptofanofluorescência no mixer microfluídicos. A região de mistura está localizado em ~ 90 uM no eixo y.

Figura 7. Espectros dependente do tempo fluorescente recolhidas no âmbito do mixer. Os rectângulos verdes e vermelhas mostram os comprimentos de onda designados como canais de dadores e aceitadores, respectivamente.

Figura 8. O tempo de mistura medido por extinção de fluorescência de triptofano por iodeto de potássio (pontos e eixo da direita) e calculado por análise de elemento finito (linha e ao eixo da esquerda).

A Figura 9. FRET alterações medidos durante a dobragem da proteína ACBP. A rápida ascensão perto t = 0 representa uma fase de ruptura dentro do tempo de mistura e mais lento o aumento representa um acumulação gradualção de estrutura como as dobras de proteína. Os dados foram obtidos em duas taxas de fluxo diferentes e sobrepostas, levando a diferentes densidades de medições em momentos diferentes.

Discussão

A mistura rápida tem sido uma meta de desenvolvimento para o campo de enovelamento de proteínas por muitos anos porque ele tem sido reconhecido que os processos moleculares de biomoléculas ocorrem em escalas de tempo que variam de picosegundos de segundos. Convencionais stopped-flow misturadores têm tempos mortos de 1-5 ms, que é limitada principalmente pela turbulência. Turbulentos misturadores de fluxo contínuo com tempos de mistura de 30-300 mS têm sido desenvolvidos nos últimos 15 anos por um pequeno número de grupos, mas geralmente exigem altas taxas de fluxo para atingir estes tempos de mistura e, portanto, usar um monte de amostra ^6-8.

Este protocolo descreve o uso de microfluídicos fichas de mistura para alcançar uma rápida diluição no regime de fluxo laminar. Existem múltiplas vantagens para trabalhar dentro deste regime, mas um um primário é a capacidade para simular todo o processo de mistura com elevada precisão, que permite uma para modificar a resposta de mistura. T-misturadores desenvolvidos por outros grupos com geom simplesetries demonstraram tempos de mistura de 100-200 mS que foram principalmente limitada pelo tamanho da canais ^9-10. Por dimensionar o tamanho dos canais a 10 uM Cavaleiro reduziu o tempo de mistura a ~ 10 microsiemens ^11. Yao e Bakajin mostraram que pequenas mudanças na geometria poderia levar a melhorias significativas no tempo de mistura ^4. No entanto, que o trabalho mostrou que a aceleração da mistura pode também conduzir a fases mais lentas também. O desenho utilizado neste trabalho ^12-13 é um compromisso entre os dois melhores modelos em referência ⁴ para minimizar o mais lento de decaimento exponencial na concentração de desnaturante e também para fazer a característica mais reprodutível em condicionamento DRIE.

Tem havido alguma controvérsia no campo de ultra-rápida misturados durante a definição do tempo de mistura. É importante reconhecer a diferença entre "tempo de mistura" e "tempo morto". O tempo morto é definido num misturador turbulento como o tempo durante o qual uma MEDIÇÃOt não pode ser feita, e pode de facto ser significativamente mais longo do que o tempo real de mistura. É tipicamente determinada por fazer várias medições de uma reacção bimolecular pseudo-primeira ordem (tais como supressão da fluorescência de triptofano por N bromosuccinate) a várias concentrações. Os decai observados exponenciais estão equipados para convergir em um único valor assumido como sendo t = 0 S e que o tempo entre o ponto eo primeiro ponto medido é o tempo morto. Para misturadores de fluxo laminar, as medições podem ser feitas durante o processo de mistura para que não haja tempo morto, apenas um tempo de mistura. O tempo de mistura é simplesmente o tempo de combinar duas soluções até uniformidade suficiente é atingido. Nós previamente definido o tempo de mistura para ser um tempo 90/10, o tempo para a concentração de desnaturante para diminuir de 90% a 10% do valor não misturado. No entanto, a forma da curva de mistura não é perfeitamente simétrica com a cauda do decaimento tendo um pequeno componente exponencial. Além disso, dobrar a proteína tem umaltamente dependência não-linear da concentração de desnaturante de modo que a dobragem pode, muitas vezes mesmo se iniciar o desnaturante só é reduzido por duas vezes. Portanto, temos, mais recentemente, o tempo de mistura definido como o tempo para reduzir a concentração de desnaturante de 80%. Certamente outras definições podem ser usados, dependendo dos requisitos da experiência.

A utilização deste misturador para estudar enrolamento de proteínas tem consistentemente revelou resultados surpreendentes. Folding de citocromo c e apomyoglobin têm sido estudadas para ter várias etapas de dobramento e os resultados iniciais com misturadores de fluxo contínuo mostrou queda para ocorrer no ~ 100 mS prazo ^10,14-15. Os nossos medições com este misturador mostrou que haja pelo menos 2 passos nesta escala de tempo, uma muito rápida, provavelmente não específica colapso, (como medido por Trp mudança de fluorescência espectral) dentro do tempo de mistura do misturador seguido por uma fase mais lenta (como medido pela têmpera do total de emissão Trp), que é provável que o first formação da estrutura nativa ^5. Observamos, também, um processo de 50 mS no domínio da proteína L B1, derrubando a interpretação convencional que essa proteína é uma pasta 2-estado ^13.

Uma vantagem deste misturador rápido é que ele pode sondar a dobragem dos mais rápidos proteínas de dobragem que geralmente têm sido apenas mensurável por nanossegundos T salto-instrumentos. T-salto tipicamente requer a observação de dobragem / desdobramento relaxamento perto da temperatura de fusão da proteína e, portanto, nunca se segue a dobra de toda a população. Com esta mesa vimos a dobra de γ-repressor (λ ^6-86) com ambos emissão total Trp e mudança espectral e encontraram evidências de que a proteína tem nenhuma barreira para dobrar sob fortes condições dobráveis ​​que não eram acessíveis a T anteriores -pular medições ^12. Finalmente, medimos o dobramento da headpiece vilina HP-35, um dos tele mais rápidos pastas ainda medidos e verificou que a taxa de dobragem medido após a mistura é de ~ 5 vezes mais lento do que medido por T-jump sob as mesmas condições ^{de 16.} Isto sugere que a cinética de dobragem depende das condições de partida, a capotagem um pressuposto importante no campo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
AZ P4110 Photoresist	Materiais AZ eletrônicos
AZ 400 Desenvolvedor K	Materiais AZ eletrônicos
Baker PRS 2000 Stripper fotorresiste	Performance Materials Avantor
AquaBond	AquaBond Technologies	AquaBond 55
500 wafer de cobertura mM	SENSOR Prep Serviços		Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espessura: 0,5 mm ± 0,025 milímetros Tolerâncias padrão (exceto quando indicado) Revestimento de superfície: SI: 4-8a; SII: 8-12a Flats: Um primária de DST-SEMI; Um Scribe Limpa e polida, os dois lados
170 wafer de cobertura mM	SENSOR Prep Serviços	7980 Wafers 2G	Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espessura: 0,17 mm ± 0,025 milímetros Tolerâncias padrão (exceto quando indicado) Revestimento de superfície: SI: 4-8a; SII: 8-12a Flats: Um primária de DST-SEMI; Um Scribe Limpa e polida, os dois lados
Etcher iônica reativa profunda para os óxidos	ULVAC	ULVAC NL-6000
Argon Laser Ion	Cambridge Laser Laboratories	Lexel 95-SHG	lambda = 258 nm
Argon Laser Ion	Melles Griot		lambda = 488 nm
Microscópio	Olimpo	IX-51
Objetiva do microscópio	Thor Labs	RLO LMU-UVB 40X-0.5 NA	lambda = 258 nm
Objetiva do microscópio	Olimpo	UPLSAPO 60XW 1,2 NA	lambda = 488 nm
Nanopositioner	Mad City Labs	Nano-LP100
Estágio Tradução Motorizada	Semprex Corp	KL-12-6436 Series
GaAsP Photon Contador	Hamamatsu	H7421-40
Monochrometer	Horiba Instruments Inc	MicroHR
CCD da câmera	Andor Tecnologia	idus 420A-BU
Cloridrato de guanidina (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505