Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

Resumo

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma excelente Ex vivo Sistema para estudar vários aspectos do desenvolvimento do pâncreas, incluindo a diferenciação morfogênese e crescimento. Explantes broto pancreático pode ser cultivada por vários dias e usado em uma variedade de aplicações diferentes, incluindo todo-mount imunofluorescência e imagem ao vivo.

Resumo

O pâncreas controla as funções vitais do nosso corpo, incluindo a produção de enzimas digestivas e regulação dos níveis de açúcar no sangue ^1. Embora na última década muitos estudos têm contribuído para uma fundação sólida para a compreensão organogênese pâncreas, importantes lacunas persistem em nosso conhecimento da formação do pâncreas precoce ^2. Uma compreensão completa dos eventos iniciais vão fornecer informações sobre o desenvolvimento do órgão, mas também de doenças incuráveis ​​que visam o pâncreas, como o diabetes ou câncer de pâncreas. Finalmente, esta informação vai gerar um modelo para o desenvolvimento de terapias de substituição de células no contexto da diabetes.

Durante a embriogénese, o pâncreas origina distintas excrescências embrionárias da endoderme foregut dorsal e ventral no dia embrionário (E) 9,5 no embrião de rato ^3,4. Ambas as excrescências evaginate no mesênquima circundante como epitélios sólidobotões L, que se submetem a proliferação, diferenciação e ramificação para gerar um órgão totalmente madura ^2,5,6. Evidências recentes sugerem que o crescimento e diferenciação de linhagens de células, incluindo pancreáticas produtoras de insulina das células β, depende do tecido adequado arquitetura remodelação, epitelial e posicionamento de célula dentro do epitélio pancreático ramificação ^7,8. No entanto, como a ramificação ocorre morfogénese e é coordenada com a proliferação e diferenciação no pâncreas é em grande parte desconhecida. Isto é em parte devido ao facto de que o conhecimento actual sobre os processos de desenvolvimento baseou-se quase exclusivamente na análise de amostras fixadas, enquanto que os eventos morfogenéticos são altamente dinâmico.

Aqui, apresentamos um método para dissecar e cultura embrionárias de camundongos pancreático ex vivo gemas em pratos de vidro de fundo, o que permite a visualização direta do pâncreas em desenvolvimento (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente concebido para a microscopia confocal laser scanning e, em particular, de imagem ao vivo de células. Explantes pancreáticas podem ser preparados não apenas a partir de embriões de rato de tipo selvagem, mas também a partir de estirpes de murganhos geneticamente modificados (por exemplo transgénico ou knockout), permitindo tempo real estudos de fenótipos mutantes. Além disso, este sistema de cultura ex vivo é útil para estudar os efeitos de compostos químicos sobre o desenvolvimento pancreático, permitindo a obtenção de dados quantitativos sobre a proliferação e crescimento, alongamento, ramificação, tubulogenesis e diferenciação. Em conclusão, o desenvolvimento de um método de pâncreas ex vivo cultura explante combinada com imagens de alta resolução fornece uma plataforma forte para observar eventos morfogenéticos e diferenciação à medida que ocorrem dentro do embrião de rato em desenvolvimento.

Protocolo

O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir da técnica originalmente descrita em Percival e Slack ⁹ e optimizados para a microscopia confocal.

1. Revestimento de pratos de vidro cultura de fundo

Os passos que se seguem devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar.

1. Explantes pancreáticas são cultivadas em placas de Petri de 35 mm com 20 mm de diâmetro de vidro de micropoços de fundo (por exemplo MatTek Corporation). Use um prato fundo de vidro por explante e cultura para toda a duração da cultura. No dia antes da dissecção e isolamento dos brotos pancreáticos, revestimento das microcavidades de vidro de fundo com a fibronectina.
2. Diluir fibronectina estéril em água de cultura de células para um grau 50 ug / ml de concentração final e adicionar um volume mínimo de la (~ pi 150) para o micropoço de 20 mm das placas Mattek cobrindo toda a superfície do vidro (Figura 1E). Coloque os pratosnum refrigerador 4 ° C por incubação durante a noite.
3. No dia da dissecção, aspirar a fibronectina, lavar a microplaca com água de grau de cultura de células e adicionar um volume mínimo de 150 ul de BME (Basal Eagle Médium) suplementados com meio de Pen / Strep (1%), glutamina (1% ) e 50 ug / ml de gentamicina [Medium Dissection]. Deixe os pratos revestidos no fluxo laminar até estar pronto para placa explantes.

Se nem todos os pratos de fibronectina-revestidos são usados, eles podem ser armazenados durante um período máximo de 1 semana a 4 ° C. Não deixe que os pratos secar, encha-os com meio de dissecção e colocá-los na geladeira.

Além de fibronectina, explantes pancreáticas foram cultivadas com sucesso em vários substratos, tais como laminina ^9, matrigel ^10,11 ou membranas microporosas ^12. Devido aos seus efeitos sobre a ramificação, usamos fibronectina ⁹ como substrato.

2. Dissecção de DBud pâncreas orsal de E11.5 - E12.5 embriões de camundongos

1. Cronometrado grávidas camundongos fêmeas no dia embrionário (E) 11,5 ou 12,5 são sacrificados e os embriões são coletados por meio de instrumentos de dissecação previamente limpas com etanol 70%. Coloque o útero dissecado em 10 cm placas contendo PBS gelado suplementado com 50 ug / ml de gentamicina.
2. Sob estereomicroscópio com iluminação de cima, o útero separado em segmentos de embriões individuais utilizando pequenas tesouras ou pinças Dumont, delicadamente descascar o músculo do útero e remoção dos embriões individuais, que estão rodeados pela decídua. Use técnicas de dissecação padrão embrião ¹³ para expor os embriões e retire o saco vitelino e âmnio. Subsequentemente, remover a parte superior do corpo do embrião (acima do fígado), e a região da cauda. Isto irá permitir que a exposição de órgãos internos (Figura 1B). Transferir o corpo médio dos embriões em placas de 10 cm, contendo gelada BME meio de dissecção.
3. Agoratransiluminação usar apenas abaixo para visualizar e dissecar o broto pancreático dorsal, ao microscópio estereoscópico. Suavemente, abra o meio-corpo do embrião, fazendo uma incisão lateral com uma pinça. Localize o estômago e baço. O broto pancreático dorsal está ligado lateralmente à região posterior do estômago (Figura 1C). Usando fórceps Dumont, dissecar afastado do broto pancreático dorsal a partir de estruturas adjacentes, tais como o estômago e do baço, mas deixando algumas mesênquima em torno do epitélio (Figura 1D). Utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, a transferência do broto isolado em uma placa de Petri de 35 mm contendo meio de dissecção gelado BME suplementado com 10% soro fetal de vitela [Meio de Cultura]. Repita essas etapas até que todos os pâncreas são isolados. Se pâncreas de diferentes genótipos são isolados, mantê-los separados usando Nunc quatro poços.

3. Revestimento e Cultura de explantes pancreáticas

Plat finalção dos explantes é efectuada em ambiente de cultura de tecido e / ou em estreita proximidade com o tecido incubadora de cultura para minimizar o movimento físico das culturas.

1. Sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar substituir o meio de dissecção BME nos pratos fibronectina revestidos com Mattek ~ ul 150 de BME meio de cultura previamente aquecido a 37 ° C.
2. Cuidadosamente, transferir os explantes pancreáticas em pratos revestidos Mattek um explante (por placa) de culturas de longo prazo, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro. Para assegurar a difusão durante a cultura, no mesênquima em torno dos explantes podem ser ligeiramente rasgada, se necessário, com uma agulha fina.
3. Suavemente, coloque as culturas num incubador de cultura de tecido (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante algumas horas para permitir que os explantes de anexar os micropoços com fundo de vidro. Uma vez que se encontram ligados, encher os pratos Mattek com 1,5 ml a 2 ml de meio de cultura de BME pré-aquecida a 37 ° C. O dia da dissecção é referido como o dia 0.
4. Homemipulation das culturas de explantes do pâncreas é realizada sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. O meio de cultura BME é alterado todos os dias, menos que os requisitos experimentais ditar calendário diferente (por exemplo, a incubação de explantes com agentes químicos). Os explantes podem ser cultivadas nestas condições durante 5 dias até uma semana.

4. Todo-mount Protocolo imunofluorescência para explantes pancreáticas

Todos os passos do protocolo de imunofluorescência (a partir de fixação de imagem) são realizados no prato MatTek mesmo, o que produz melhores imagens do que um prato de plástico de fundo. Após a fixação, as culturas de explantes pancreáticas não precisam de ser mantidas sob condições estéreis.

1. Aspirar BME meio de cultura e lava-se o explante, uma vez com 2 ml de PBS 1X.
2. Para a fixação do explante substitua com 2 ml de PBS gelado paraformaldeído a 4% (PFA), e introduzir a cápsula em gelo durante 20 min. Redemoinho a placa suavemente de tempo paratempo, mas evitar plataformas de balanço, como o explante pode separar.
3. Remover PFA e lavar os explantes três vezes com 2 ml de 1X PBS durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente (RT).
4. Bloco com 2 ml de solução de bloqueio (1X PBS + 0,1% de Triton-X + Donkey 3% de soro) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
5. Diluir o anticorpo primário em solução de bloqueio e adicionar 150 ul ~ da diluição directamente na microplaca de 20 mm das placas Mattek cobrindo toda a superfície dos explantes para incubação durante a noite a 4 ° C. Para minimizar os movimentos físicos, adicionar o anticorpo primário para os explantes directamente na câmara fria (4 ° C). Para evitar a evaporação, antes de se adicionar o anticorpo, colocar as placas Mattek numa câmara húmida.
6. No dia seguinte, remover a solução de anticorpos e lavar três vezes com 2 ml de 1X PBS + 0,1% de Tween-20 (PBT), durante 30 minutos cada à temperatura ambiente.
7. Diluir o anticorpo secundário em solução de bloqueio [de acordo com as recomendações do fabricante; usamos corantes Alexa Fluor de burro anti secundáriocorpos de diluição 1:750] e adicionar 150 ul ~ da diluição directamente na microplaca de 20 mm das placas Mattek, cobrindo toda a superfície dos explantes, durante 1-2 horas de incubação à temperatura ambiente no escuro. Para contracoloração nuclear, a Hoechst incluem, juntamente com a diluição de anticorpo secundário. Para evitar a evaporação, antes de se adicionar o anticorpo, colocar as placas Mattek numa câmara húmida.
8. Lavar três vezes com 2 ml de 1X PBS + 0,1% de Tween-20 (PBT), durante 30 minutos cada à temperatura ambiente.
9. Antes da montagem, lavar uma vez com 1X PBS para remover o Tween-20. Montar, adicionando uma gota de meio de montagem aquoso (com anti-desbotamento) para o micropoço de 20 mm das placas Mattek. Gentilmente, cobrir o explante com uma lamela de vidro. Evite bolhas de ar.
10. Os explantes em placas Mattek podem ser visualizados por microscopia de contraste de fase normal ou de microscopia confocal, de acordo com os objectivos da experiência. Para análise por microscopia confocal, usamos um Zeiss LSM 700 configuração invertida. Configure lasers apropriados para fluoróforos nosed. Seleccionar um objectivo que será a imagem da área desejada do explante pancreático. Um objectivo da água de imersão-10X é adequado para manter o explante inteiro no campo de visão. Um objectivos 40X água ou de imersão em óleo são adequados para se concentrar em regiões específicas do explante pancreática com maior resolução. Os explantes podem ser opticamente seccionado e, em seguida, o Z-adquirido pilhas reconstruída em 3D, utilizando software apropriado.

5. Live-célula de imagem Protocolo de explantes pancreáticas

1. Configuração de câmara ambiental: usar um gabinete ambiental e uma câmara de incubação pequeno [com a temperatura e controle de CO _2] que se senta no palco microscópio. Cultura adequado do pâncreas embrionário requer uma temperatura estável de 37 ° C e numa atmosfera controlada de 5% de CO ₂ humidificado. Câmaras adequadas estão disponíveis a partir de vários fornecedores (Por exemplo, Zeiss, Nikon, Olympus). Montar a caixa de aquecimento e transformá-lo em umpelo menos t 1 hr antes de imagem comece a permitir que o equipamento para aquecer e equilibrar teor de CO ₂ a 5%.
2. Por lapso de tempo de imagem de culturas de explante pancreáticas, usamos um LSM 700 microscópio invertido Zeiss. Para lasers e seleção objetiva ver ponto 4.10.
3. Deixe o explante pancreático anexar bem para o prato com fundo de vidro antes de iniciar a criação de imagens ao vivo. [Nós geralmente realizar imagem ao vivo a partir do Dia 1].
   Em uma câmara de fluxo laminar, aspirar e substituir o meio de explante com meio fresco de cultura de BME para começar com as melhores condições de nutrientes.
4. Suavemente transferir os explantes para a sala de microscópio e colocar o prato MatTek na câmara de incubação para o suporte de amostras de um microscópio confocal.
5. Prepare o objectivo (por exemplo, adicionar óleo ou água médio de acordo com a escolha da objectiva de imersão) e concentrar-se na região de interesse no explante. Feche a câmara ambiental corretamente. Para evitar a evaporação durante lapso de tempoaquisição com água de imersão-objectivos, em lugar de água, recomenda-se a utilização de fluidos de imersão viscosas que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Zeiss Immersol W).
6. Configure intensidade do laser, os parâmetros Z-stack de aquisição e intervalo de tempo (ver também discussão para solução de problemas). Iniciar a experiência.
7. Depois de imagem, Z exportação pilhas e todos os pontos de tempo e analisá-los usando o software adequado (por exemplo ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).

6. Resultados representativos

Brotos pancreáticos dorsais (juntamente com o mesênquima envolvente) foram dissecados a partir de embriões de rato E11.5 e E12.5 entre e plaqueadas directamente em pratos de vidro de fundo de cultura (Figura 1). Os vasos sanguíneos estão presentes no mesênquima em torno do epitélio e podem ser visualizadas por imunocoloração para o marcador endotelial PECAM ¹² (dados não mostrados). Após dois dias de cultura und, explantes pancreáticoerwent crescimento significativo e começou a organizar-se em estruturas ramificadas epiteliais, cujos núcleos foram positivos para o fator de transcrição de pâncreas, Pdx1 (Figura 2A-C). A média z de espessura de explantes pancreáticos no dia 3 de cultura é 60-80 ^ m. A superfície eo volume dos explantes pode ser medida utilizando software apropriado (por exemplo, Huygens). Análises da morfologia e imunofluorescência mostrou que os explantes pancreáticas cultivadas utilizando este protocolo recapitulado diferenciação in vivo pancreático precoce e eventos morfogenéticos ^5,10,11,14 (Figura 2). Explantes pancreáticos no dia 4 de cultura foram submetidos a "ponta e tronco" típico segregação do epitélio ^8, exibindo CPA1 + células progenitoras nas pontas dos ramos epiteliais (Figura 2C) e + insulina diferenciadas e + glucagon células organizadas como aglomerados dentro do tronco (Figura 2D ). Além disso, o pancreatic epitélio em culturas ex vivo demonstraram a organização do citoesqueleto celular adequada e polaridade, com localização apical de F-actina (Figura 2E, a verde) e b1-integrina nas membranas basais (Figura 2E, a vermelho).

Para estudar pancreático ramificação em tempo real, os explantes de embriões pancreáticos foram isolados a partir da estirpe de ratinhos duplo-cor fluorescente repórter membrane-Tomato/membrane-Green ¹⁵ (mT / mG; estirpe de ratinho está disponível no Laboratório Jackson) (Figura 3). Ainda imagens de um vídeo de lapso de tempo de explantes mT / mG pancreáticas cultivadas em cultura são mostrados na Figura 3. A localização da proteína fluorescente mT a estruturas de membrana descreve a morfologia das células e permite a resolução de finos processos celulares, permitindo controlar a remodelação e migração de células ao longo do tempo.

Depois de uma experiência de 12 horas de lapso de tempo o MT sinal de fluorescência permanece viável e deteCTable, embora a sua intensidade é reduzida, provavelmente devido a fotoenvelhecimento (Figura 3). Soluções técnicas para evitar ou reduzir o fotoenvelhecimento e fototoxicidade são discutidos na seção Discussão.

Figura 1. Representação esquemática da dissecação dorsal pâncreas broto de embrião de rato E12.5. (A) imagem de Brightfield E12.5 embrião de rato. A parte superior do corpo do embrião (acima do fígado), e a região da cauda são removidos para isolar o meio-corpo (B). As incisões são mostrados por linhas pontilhadas vermelho. (C) Outros resultados de dissecção em exposição do estômago e do duodeno região (indicado pela caixa tracejada). O broto pancreático dorsal (ver círculo pontilhado vermelho) está na base do estômago e ao lado do primórdio baço. O broto pancreático dorsal dissecado (D) é transferida com uma pipeta de Pasteur para a micropoços de uma placa de fundo de vidro contendo meio de cultura de BME (E, F). Abreviaturas: STO (estômago), sp (baço), dp (broto pancreático dorsal), duo (duodeno). Barras de escala, 1000 ^ m (A, C).

Figura 2. Todo-mount análise confocal de imunofluorescência de culturas de explante pancreáticas. (A) as imagens de campo claro de explantes pancreáticos no dia 1 e no dia 2 de cultura ex vivo. Linha pontilhada vermelha indica o início da ramificação do epitélio. (B) a reconstrução 3D de todo-mount imunomarcação para Pdx1 no dia 3 de pâncreas cultura. Explantes pancreáticas mostrou túbulos de Pdx1 + células submetidos a extensa ramificação por 48 horas de culturas. (C) imunomarcação Whole-mount do dia explante pancreático 3 com anticorpos contra o marcador de membrana basolateral da E-caderina (Ecad), marcador de ponta progenitor, carboxipeptidase 1 (CPA1) e fosfo-Histona H3 (phh3). A maior parte da mitose ativa phh3 + células colocalize nas pontas periféricos com CPA1 + células. L tracejadaines indicam ponta dos ramos. (D) imunomarcação inteiro de montagem para os marcadores de linhagem endócrinas, insulina (Ins) e glucagon (Gluca) no dia 3. Setas amarelas indicam grupos de Ins + e + Gluca células. Inset (D '), uma maior ampliação de um dos do aglomerado de células endócrinas. (E) imunomarcação Todo-mount do dia explante pancreático 3 para Pdx1, β1 integrina (β1int) e F-actina (Fato). As células mesenquimais (asteriscos) intercalados entre Pdx1-células epiteliais positivas. As imagens mostradas C, D e E são únicos confocal secções ópticas de Z-série. Barras de escala, 100 um (A, B), 50 uM (CE).

Figura 3. Imagem ao vivo de células Representante do ex explante pancreático vivo culta. (AD) quadros de um filme de lapso de tempo de um explante de pâncreas de uma mT / mG embrião transgênico mouse. Tempo de formação de imagens é mostrado em horas: minutos. O explante foi fotografada a partir de dia 1. Z-stack imagensforam adquiridas com uma objectiva de 40x de imersão em óleo a cada 12 min durante um total de 15 horas. As linhas tracejadas indicam ponta dos ramos e de fronteira entre epitélio e mesênquima. Barra de escala, 50 mm.

Discussão

Uma vez que o destino é especificado pancreático, de células progenitoras do pâncreas sofrer proliferação extensiva, a diferenciação e a morfogénese para eventualmente formar um órgão funcional maduro e ^2,4. No presente, como a ramificação ocorre no pâncreas e como ele é ligado a proliferação e diferenciação de células progenitoras é em grande parte desconhecida. Culturas de explantes de pâncreas representa um sistema ideal para elucidar esses processos ex vivo ^5,9,11. Ao combinar live-cél...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos: Carboxipeptidase E-caderina F-actina Glucagon Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-Histona H3	Abd Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hibridoma banco Sinalização celular	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Médio Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Mantidos em condições estéreis
Água de grau de cultura de células	PAA	S15-012	Mantidos em condições estéreis
Placas de cultura (com fundo de vidro), de 35 mm	MatTek Corporação	P35G-0-20-C
Donkey soro	Chemicon	S30-100 ml
Soro fetal de vitelo Ouro	PAA	A15-151	Mantidos em condições estéreis
Fibronectina	Invitrogen	330100-8	Estoque sol. 1 mg / ml em água de grau de cultura de células
Gentamicina	Invitrogen	15750-037	Mantidos em condições estéreis
Glutamina	Invitrogen	25030-024	Mantidos em condições estéreis
4-bem multiplacas	Nunc	176740
Microscópios: Microscópio confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscópio (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objetivos: C Apochromat-10X / 0,45 W M27 (work. dist 1,8 mm;. Profundidade de imagem ~ 100 mm); Apochromat C-40X / 1,2 W Corr M27 (work. dist 0,28 milímetros;. ~ Profundidade de imagem 50 mm) Transiluminação partir de baixo e de fibra óptica de iluminação a partir de cima
Paraformaldeído	Roth	0.335,3	Solução-mãe de 20%
Pasteur Pipeta (vidro), 150 mm	VWR	HECH567 / 1
Penicilina / estreptomicina	PAA	P11-010	Mantido em c estérils condições
As placas de Petri, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Placas de Petri, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH 7,4	PAA	H15-002	Mantidos em condições estéreis
Primavera Tesoura lâmina de 8 mm curvo	Belas Science Tools	15023-10
Triton X100	Roth	3051,3
Foreceps relojoeiro Dumont # 5	Roth	K342.1