Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

Resumo

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma excelente Ex vivo Sistema para estudar vários aspectos do desenvolvimento do pâncreas, incluindo a diferenciação morfogênese e crescimento. Explantes broto pancreático pode ser cultivada por vários dias e usado em uma variedade de aplicações diferentes, incluindo todo-mount imunofluorescência e imagem ao vivo.

Resumo

O pâncreas controla as funções vitais do nosso corpo, incluindo a produção de enzimas digestivas e regulação dos níveis de açúcar no sangue ^1. Embora na última década muitos estudos têm contribuído para uma fundação sólida para a compreensão organogênese pâncreas, importantes lacunas persistem em nosso conhecimento da formação do pâncreas precoce ^2. Uma compreensão completa dos eventos iniciais vão fornecer informações sobre o desenvolvimento do órgão, mas também de doenças incuráveis ​​que visam o pâncreas, como o diabetes ou câncer de pâncreas. Finalmente, esta informação vai gerar um modelo para o desenvolvimento de terapias de substituição de células no contexto da diabetes.

Durante a embriogénese, o pâncreas origina distintas excrescências embrionárias da endoderme foregut dorsal e ventral no dia embrionário (E) 9,5 no embrião de rato ^3,4. Ambas as excrescências evaginate no mesênquima circundante como epitélios sólidobotões L, que se submetem a proliferação, diferenciação e ramificação para gerar um órgão totalmente madura ^2,5,6. Evidências recentes sugerem que o crescimento e diferenciação de linhagens de células, incluindo pancreáticas produtoras de insulina das células β, depende do tecido adequado arquitetura remodelação, epitelial e posicionamento de célula dentro do epitélio pancreático ramificação ^7,8. No entanto, como a ramificação ocorre morfogénese e é coordenada com a proliferação e diferenciação no pâncreas é em grande parte desconhecida. Isto é em parte devido ao facto de que o conhecimento actual sobre os processos de desenvolvimento baseou-se quase exclusivamente na análise de amostras fixadas, enquanto que os eventos morfogenéticos são altamente dinâmico.

Aqui, apresentamos um método para dissecar e cultura embrionárias de camundongos pancreático ex vivo gemas em pratos de vidro de fundo, o que permite a visualização direta do pâncreas em desenvolvimento (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente concebido para a microscopia confocal laser scanning e, em particular, de imagem ao vivo de células. Explantes pancreáticas podem ser preparados não apenas a partir de embriões de rato de tipo selvagem, mas também a partir de estirpes de murganhos geneticamente modificados (por exemplo transgénico ou knockout), permitindo tempo real estudos de fenótipos mutantes. Além disso, este sistema de cultura ex vivo é útil para estudar os efeitos de compostos químicos sobre o desenvolvimento pancreático, permitindo a obtenção de dados quantitativos sobre a proliferação e crescimento, alongamento, ramificação, tubulogenesis e diferenciação. Em conclusão, o desenvolvimento de um método de pâncreas ex vivo cultura explante combinada com imagens de alta resolução fornece uma plataforma forte para observar eventos morfogenéticos e diferenciação à medida que ocorrem dentro do embrião de rato em desenvolvimento.

Protocolo

O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir da técnica originalmente descrita em Percival e Slack ⁹ e optimizados para a microscopia confocal.

1. Revestimento de pratos de vidro cultura de fundo

Os passos que se seguem devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar.

1. Explantes pancreáticas são cultivadas em placas de Petri de 35 mm com 20 mm de diâmetro de vidro de micropoços de fundo (por exemplo MatTek Corporation). Use um prato fundo de vidro por explante e cultura para toda a duração da cultura. No dia antes da dissecção e isolamento dos brotos pa....

Discussão

Uma vez que o destino é especificado pancreático, de células progenitoras do pâncreas sofrer proliferação extensiva, a diferenciação e a morfogénese para eventualmente formar um órgão funcional maduro e ^2,4. No presente, como a ramificação ocorre no pâncreas e como ele é ligado a proliferação e diferenciação de células progenitoras é em grande parte desconhecida. Culturas de explantes de pâncreas representa um sistema ideal para elucidar esses processos ex vivo ^5,9,11. Ao combinar live-cél.......

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos: Carboxipeptidase E-caderina F-actina Glucagon Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-Histona H3	Abd Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hibridoma banco Sinalização celular	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Médio Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Mantidos em condições estéreis
Água de grau de cultura de células	PAA	S15-012	Mantidos em condições estéreis
Placas de cultura (com fundo de vidro), de 35 mm	MatTek Corporação	P35G-0-20-C
Donkey soro	Chemicon	S30-100 ml
Soro fetal de vitelo Ouro	PAA	A15-151	Mantidos em condições estéreis
Fibronectina	Invitrogen	330100-8	Estoque sol. 1 mg / ml em água de grau de cultura de células
Gentamicina	Invitrogen	15750-037	Mantidos em condições estéreis
Glutamina	Invitrogen	25030-024	Mantidos em condições estéreis
4-bem multiplacas	Nunc	176740
Microscópios: Microscópio confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscópio (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objetivos: C Apochromat-10X / 0,45 W M27 (work. dist 1,8 mm;. Profundidade de imagem ~ 100 mm); Apochromat C-40X / 1,2 W Corr M27 (work. dist 0,28 milímetros;. ~ Profundidade de imagem 50 mm) Transiluminação partir de baixo e de fibra óptica de iluminação a partir de cima
Paraformaldeído	Roth	0.335,3	Solução-mãe de 20%
Pasteur Pipeta (vidro), 150 mm	VWR	HECH567 / 1
Penicilina / estreptomicina	PAA	P11-010	Mantido em c estérils condições
As placas de Petri, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Placas de Petri, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH 7,4	PAA	H15-002	Mantidos em condições estéreis
Primavera Tesoura lâmina de 8 mm curvo	Belas Science Tools	15023-10
Triton X100	Roth	3051,3
Foreceps relojoeiro Dumont # 5	Roth	K342.1