Fusão mitocondrial foi medida seguindo o equilíbrio da GFP matriz segmentada photoconverted através da rede mitocondrial ao longo do tempo. Até agora, apenas uma célula possa ser sujeita a uma análise de longo horas cinética de cada vez. Nós apresentamos um método que mede simultaneamente várias células, acelerando assim o processo de coleta de dados.
Artigo de método
Uma resolução mais rápida, alta, MTPA-GFP baseada em ensaio de fusão mitocondrial aquisição de dados cinéticos de várias células em paralelo usando microscopia confocal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fusão mitocondrial desempenha um papel essencial na homeostase de cálcio mitocondrial, bioenergética, autofagia e controle de qualidade. A fusão é quantificada em células vivas por meio da fotoconversão da GFP fotoativável direcionada à matriz (mtPAGFP) em um subconjunto de mitocôndrias. A taxa na qual as moléculas fotoconvertidas se equilibram em toda a população mitocondrial é utilizada como medida da atividade de fusão. Até agora, as medições foram realizadas usando uma abordagem de lapso de tempo em uma única célula, quantificando o equilíbrio em uma célula ao longo de uma hora. Aqui, ampliamos e automatizamos um método previamente publicado em células vivas baseado no uso de mtPAGFP e uma baixa concentração de TMRE (15 nm). Este método envolve a fotoativação de uma pequena porção da rede mitocondrial, a coleta de pilhas altamente resolvidas de seções confocais a cada 15 minutos durante 1 hora e a quantificação da alteração na intensidade do sinal. Dependendo de vários fatores, como a facilidade de encontrar células que expressam PAGFP e o sinal das regiões fotoativadas, é possível coletar cerca de 10 células dentro dos intervalos de 15 minutos. Isso proporciona uma melhoria significativa na eficiência temporal deste ensaio, mantendo a quantificação subcelular altamente resolvida, bem como os parâmetros cinéticos necessários para capturar os detalhes do comportamento mitocondrial em seu ambiente citoplasmático nativo.
A dinâmica mitocondrial desempenha um papel em diversos processos celulares, incluindo respiração, regulação do cálcio e apoptose1,2,3,13. A estrutura da rede mitocondrial afeta a função das mitocôndrias e a maneira como elas interagem com o restante da célula. Sujeitas a divisão e fusão constantes, as redes mitocondriais assumem diversas formas, variando desde redes altamente fundidas até redes mais fragmentadas. Curiosamente, doenças como Alzheimer, Parkinson, Charcot Marie Tooth 2A e atrofia óptica dominante têm sido correlacionadas com alterações na morfologia mitocondrial, especificamente redes fragmentadas4,10,13. Muitas vezes, após a fragmentação, as mitocôndrias se tornam despolarizadas, e com o acúmulo dessas mitocôndrias, ocorre comprometimento da função celular18. A fissão mitocondrial tem sido associada à sinalização para a progressão da célula em direção à apoptose. Ela também pode fornecer um mecanismo para separar mitocôndrias despolarizadas e inativas, mantendo a maior parte da rede saudável14. A fusão mitocondrial, por outro lado, permite a troca de proteínas da matriz, solutos, mtDNA e gradiente eletroquímico, e aparentemente evita a progressão para a apoptose9. Como a fissão e a fusão mitocondriais afetam a homeostase celular e, em última instância, o funcionamento do organismo, ainda precisa ser mais bem compreendido; portanto, é necessário o contínuo desenvolvimento e aprimoramento de métodos para obter informações sobre esses fenômenos.
Ensaios existentes de fusão mitocondrial revelaram diversas percepções sobre a fisiologia mitocondrial, cada um com suas próprias vantagens. O ensaio de fusão por PEG híbrido7 mistura duas populações de células marcadas de forma distinta (mtRFP e mtYFP) e analisa a quantidade de mistura e colocalização de fluoróforos em células fundidas e multinucleadas. Embora este método tenha gerado informações valiosas, nem todos os tipos celulares podem se fundir, e as condições nas quais a fusão é estimulada envolvem o uso de drogas tóxicas que provavelmente afetam o processo normal de fusão. Mais recentemente, uma técnica livre de células foi desenvolvida, utilizando mitocôndrias isoladas para observar eventos de fusão com base em um ensaio de luciferase1,5. Duas linhagens celulares humanas são alvejadas com a parte amino ou carboxi terminal da luciferase de Renilla, juntamente com um zíper de leucina para garantir a dimerização após a mistura. Mitocôndrias são isoladas de cada linhagem celular e fundidas. A reação de fusão pode ocorrer sem o citosol em condições fisiológicas na presença de energia, temperatura adequada e potencial da membrana mitocondrial interna. Curiosamente, descobriu-se que o citosol modula a extensão da fusão, demonstrando que a sinalização celular regula o processo de fusão 4,5. Este ensaio será muito útil para triagem em alta produtividade na identificação de componentes da maquinaria de fusão, bem como de compostos farmacológicos que possam afetar a dinâmica mitocondrial. No entanto, ensaios mitocondriais mais detalhados em células inteiras serão necessários para complementar este ensaio in vitro e observar esses eventos em um ambiente celular.
Uma técnica para monitorar a dinâmica mitocondrial em células inteiras tem sido utilizada há algum tempo e baseia-se em uma GFP fotoativável direcionada às mitocôndrias (mtPAGFP)6,11. Após a expressão da mtPAGFP, uma pequena porção da rede mitocondrial é fotoativada (10-20%), e a propagação do sinal para o restante da rede mitocondrial é registrada a cada 15 minutos durante 1 hora, utilizando microscopia confocal com imagens em intervalos de tempo. Cada evento de fusão resulta em uma diluição da intensidade do sinal, permitindo a quantificação da taxa de fusão. Embora fusão e fissão ocorram continuamente nas células, esta técnica monitora apenas a fusão, pois a fissão não provoca diluição do sinal da PAGFP6. A marcação simultânea com baixos níveis de TMRE (7-15 nM em células INS1) permite a quantificação do potencial de membrana das mitocôndrias. Quando as mitocôndrias estão hiperpolarizadas, elas absorvem mais TMRE, e quando se despolarizam, perdem o corante TMRE. Mitocôndrias despolarizadas não possuem mais potencial de membrana suficiente e tendem a não fundir de maneira eficiente, ou não fundem de todo. Portanto, mitocôndrias ativas na fusão podem ser rastreadas com esses baixos níveis de TMRE9,15. O acúmulo de mitocôndrias despolarizadas que não apresentam sinal de TMRE pode ser um indicativo de fototoxicidade ou morte celular. Concentrações mais elevadas de TMRE tornam as mitocôndrias muito sensíveis à luz do laser, e, portanto, é necessário ter grande cuidado para evitar marcação excessiva com TMRE. Se o efeito da despolarização mitocondrial for o foco do estudo, pode-se utilizar uma técnica com níveis ligeiramente mais altos de TMRE e luz laser mais intensa para despolarizar as mitocôndrias de forma controlada (Mitra e Lippincott-Schwartz, 2010). Para garantir que a toxicidade devida ao TMRE não seja um problema, sugerimos expor células carregadas (3-15 nM de TMRE) aos parâmetros de imagem que serão utilizados no ensaio (talvez 7 séries de 6 seções ópticas consecutivas) e avaliar a saúde celular após 2 horas. Se as mitocôndrias parecerem excessivamente fragmentadas e as células estiverem morrendo, outros marcadores mitocondriais, como dsRED ou Mitotracker red, poderão ser utilizados em substituição ao TMRE.
O método mtPAGFP revelou detalhes sobre o comportamento da rede mitocondrial que não podiam ser visualizados usando outros métodos. Por exemplo, sabe-se agora que a fusão mitocondrial pode ser completa ou transitória, na qual o conteúdo da matriz pode se misturar sem alterar a morfologia geral da rede. Além disso, sabe-se que a probabilidade de fusão é independente da duração do contato e da dimensão dos organoides, sendo influenciada pela motilidade dos organoides, potencial de membrana e histórico de atividade de fusão anterior8,15,16,17.
Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia para ampliar o protocolo previamente publicado utilizando mtPAGFP e TMRE 15 nM8 a fim de examinar múltiplas células simultaneamente e melhorar a eficiência temporal da coleta de dados sem sacrificar a resolução subcelular. Isso foi possível graças ao uso de uma platina automatizada de microscópio e software programável de aquisição de imagens. O software Zen da Zeiss permite ao usuário marcar e rastrear várias células designadas que expressam mtPAGFP. Cada uma dessas células pode ter seu mtPAGFP fotoativado em uma região específica de interesse, e pilhas de cortes confocais podem ser monitoradas quanto ao sinal de mtPAGFP, bem como de TMRE, em intervalos determinados. Outros sistemas confocais poderiam ser utilizados para executar este protocolo, desde que disponham de uma platina automatizada e programável, e uma incubadora com CO2e um meio para fotoativar o PAGFP; seja um laser de múltiplos fótons, seja um laser de diodo de 405 nm.
Protocolo
1. Preparação Placa Imagem
- Cultura INS1 células em meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino padrão, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM de NaHCO3, 2 mM de HEPES, 2 mM de ácido pirúvico, e 11 mM de glucose a 80% de confluência.
- Trypsinize as culturas de células INS1 com tripsina a 0,05% ea placa-los em poli-D-lisina placas revestidas com lamela de fundo de imagem (% de confluência 30-40).
- Permitir para placas de atingir confluência de 60-80% (~ 2 dias) e adicionar matriz mitocondrial alvo (COXVIII) adenoviral PA-GFP durante 24 horas (MOI = 5). Meios câmbio e permitem que as células a crescer por mais 2 dias antes de imagem.
- No dia da imagem, adicionar 7-15 TMRE nM para as placas de imagem, e equilibrar durante pelo menos 45 min.
- Durante este por sua vez, tempo na incubadora (fase superior incubadora tem sido usado aqui) e permitir que o microscópio para equilibrar a 37 ° C durante cerca de 1 hora. Ligue o 5% de CO 2.
2. Parâmetros de imagem para a LSM 710 microscópio confocal Zeiss
- Após o microscópio tem equilibrado, sob a guia de Aquisição, clique em "Ferramentas manual mostram", abra a imagem criada painel e escolha "modo de canal" e mude acompanhar cada "frame".
- No painel caminho da luz, escolha LSM e modo de canal. Trabalhando a partir do ícone do espécime para cima, selecione "traseiro", MBS 690 +, e MBS 488. Na parte inferior do painel, escolher "T-PMT", para permitir a visualização do campo brilhante ou canal DIC.
- Termine o ajuste dos parâmetros de caminho de luz, definindo o intervalo para o corante GFP para 490-540 nm e 580-700 nm para o corante TMRE.
- No modo de aquisição, use um de 512 × 512 pixels campo de leitura, 4x médios, e escolher um fator de zoom (que você pode querer manter consistente para fins de calibração).
3. Otimizar os parâmetros de imagem
- Usando o Apochromat plano 100x (1,4 NA) lente objetiva, focnos em suas células com a luz halógena não, luz fluorescente, para proteger as mitocôndrias de fototoxicidade.
- Tela para PA-GFP células que expressam através de um orifício aberto e máxima de varredura para encontrar as células que são mais brilhantes verde.
- Encontrar a mais baixa potência do laser 2-fotão necessária para activar a PA-GFP e optimizar os parâmetros de imagem que assegurem que o sinal não saturar o detector. Verificar que o sinal PA-GFP colocalizes com o sinal de TMRE para poucos z-série. Perda do sinal de TMRE indica despolarização mitocondrial ou fototoxicidade, e as células apresentando estas características não deve ser utilizado para a análise.
- Encontre uma célula PA-GFP expressar e especificar um fator de zoom.
- Defina o intervalo de z-série para coletar 6 fatias (este intervalo será necessário para satisfazer todas as 10 células a menos que um específico z foco é definida em cada posição).
- Salve o método de imagem para cada célula (célula 1, célula 2 etc.)
4. Ajuste o AutomateParcela d do Programa e designar as 10 células a serem seguidas para o 1 ensaio de fusão Hora mitocondrial
- No painel esquerdo da janela multitime, selecione a opção "salvar" do painel, e especifique o local onde os arquivos serão salvos.
- Em a "Aquisição" do painel, carregue o método de aquisição salvo para a célula 1 na configuração de digitalização e marque a caixa de pilha z. Além disso, escolha "marcado Z-meio da pilha z".
- No "blocos" do painel, selecione "bloco único em cada local". Clique em "Adicionar" blocos para cada intervalo a ser medido.
- No "timing" do painel, selecione "esperar intervalo" e digite "0" no "intervalo de espera antes de bloco no primeiro local só". Blocos 2-4 terá "15 minutos" nesta seção.
- No painel Local, escolha "mover o foco para carregar posição entre os locais" e "carga varredura config quando 'mover-se para loc" ou "próximo loc' clicado. Sob a" lista de locais de edição "escolher" limpar tudo "e selecione" múltipla locais motorizada palco ".
- Under o "Bleach" do painel, clique em "branquear" caixa, e designar o arquivo de configuração no "config" no menu suspenso, como designado na janela do software principal. Em seguida, no "branqueamento" janela, salve o método de fotoativação apropriado. No painel regiões, escolha o ROI dessa célula em particular, e adicionar este ROI para o multitime escolhendo "região atual adicionar à lista de ROI" janela. Certifique-se de selecionar o mesmo local na "ROI" no menu suspenso.
Para a temporização para funcionar correctamente e para cada célula de ter um intervalo de 15 minutos, dois métodos necessitam de ser guardada. Na lista de blocos, o primeiro terá a configuração de fotoativação "real", eo resto vai ter uma configuração "mock" que não usa o laser de dois fótons. O primeiro bloco também será o único bloco que não tem um atraso (BKIntv = 0). Portanto, o método começa com um exame inicial, seguido de uma verificação de fotoactivação. O resto dos blocos têm um 900 seg BkIntv, eem cada ponto de tempo, existem dois exames assim como em tempo de 0 segundos, para manter a consistência de temporização.
- Para cada uma das 10 células a serem seguidos ao longo do tempo, realizar esta sequência:
Encontre um PAGFP expressar células salvar seu método de imagem
Localização do painel de marcar a posição etapa, especificar o método de imagem
Principal ROI painel de escolher uma região de interesse para ser Bleach fotoativado painel de salvar ROI específico e também carregá-lo na caixa de ROI:
Apague o ROI e redefinir o zoom varredura a 1
Encontrar a próxima célula e definir o zoom
Repetir o processo para os próximos 9 células
Verifique se cada local palco e todos os blocos têm o método de imagem adequado (scan configuração) associado. Também certifique-se que o primeiro bloco em cada local corresponde ao método de fotoativação apropriado, enquanto o resto conter um método "mock". Finalmente, selecione "executar".
5. Analisar a intensidade do sinal PA-GFP
- Para as células em que o sinal fotoactivável-GFP colocalizes com o sinal de TMRE vermelho, subtrair o fundo nas imagens PAGFP (aqui usamos metamorph).
- Em seguida, exportar os dados para o Excel e calcular a intensidade média de z-pilhas em cada momento. Descartar secções ópticas que não têm nenhum sinal.
- Medir a diluição do sinal em cada pilha z-através do cálculo da percentagem do sinal original fotoativado.
Cada ponto de dados é digitalizado e registada duas vezes, resultando em informações z pilha duplicado para cada ponto de tempo. Verifique se os valores z-stack concordar. Se não, o que é indicativo de um problema (por exemplo, o foco do movimento das células,).
6. Os resultados representativos
Quando um evento de fusão ocorre entre uma activado e não-activado PA-GFP mitocôndria, o PAGFP dentro da matriz mitocondrial mistura-se com a matriz não-etiquetados e torna-se diluída sobre uma área maior, diminuindo o sinalintensidade (Figura 1A). Na célula INS1, uma diminuição significativa da intensidade do sinal ocorre a cada 15 minutos, até que o equilíbrio de fusão mitocondrial foi atingido (aproximadamente 1 hora). Note-se que a célula na Figura 1B apresenta colocalização quase completo de PA-GFP e os sinais de TMRE. Nestes ensaios uma concentração muito baixa de TMRE (15 nM) é usado para ajudar a atingir o fotoactivação de PAGFP, e também para controlar a saúde célula. As células com uma abundância de mitocôndrias despolarizada terá colocalização incompleta de PAGFP e TMRE e não devem ser analisados, porque isso indica quer fototoxicidade, ou células num estado de morrer.
O tempo de equilíbrio para a fusão mitocondrial é geralmente de 1 hora em INS1 células, quando ~ 15% do volume mitocondrial é activado. Às vezes, mesmo se uma pequena área é iluminada, a maioria das mitocôndrias tornar-se fotoativados devido a ser altamente rede, caso em que a fusão adicional é difícil de detectar. Outros tipos de células podem apresentar tempos de equilíbrio diferentes, e devem ser testados em intervalos mais curtos e mais de um período mais longo para caracterizar a dinâmica mitocondriais. Para inibir a fusão mitocondrial, as células podem ser colocadas dentro de um ambiente lipotoxic. Foi previamente demonstrado que 0,4 mM palmitato fragmentos mitocôndrias, e inibe a fusão mitocondrial 9. Este efeito pode ser visto na Figura 2, onde as mitocôndrias são fragmentados, mas a intensidade do sinal da mtPAGFP não muda, tanto quanto sob condições normais (Figura 1). Portanto, a diluição do sinal PA-GFP é provável que seja devido à fusão mitocondrial em vez de fissão. Em outros tipos de células, sugerimos utilizando outros métodos conhecidos para induzir a fragmentação mitocondrial, tais como o silenciamento OPA1 que é necessária para a fusão mitocondrial 14.
Figura 1. diluição típica do sinal PA-GFP após fotoactivação durante um ensaio de fusão mitocondrial. A. PA-GFP se torna progressivamente mais escura devido a eventos de fusão mitocondriais que conduzem à diluição da proteína sobre uma área crescente como pode ser visto nestas imagens projectadas de 6 secções ópticas quantificado em intervalos de 15 minutos. B. TMRE com PA-GFP mostra que as mitocôndrias são ativos e não despolarizada. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Fusão mitocondrial inibida com 0,4 mM de palmitato diminui a diluição de PA-GFP. A. Projecções de 6 secções ópticas mostrando mitocôndrias curto com uma intensidade de sinal imutável ao longo do tempo. B. colocalização de PA-GFP com TMRE mostra que as mitocôndrias não são depolarizada. Clique aqui para ver maior figura .
Discussão
Este método permite a criação de imagens de cerca de 10 células de cada vez, se a aquisição ocorre a cada 15 minutos após a fotoactivação. O número exato de células dependerá da rapidez com que um é capaz de localizar e marcar as células que expressam mtPAGFP dentro da placa de cultura, e quão rapidamente pode-se configurar todos os parâmetros de software. Para fazer a automação de correr suavemente uma camada uniforme de células deve ser usado porque os designados z-stack margens será aplicada para todas as células.
O tamanho desta área fotoactivação inicial regerá o tempo de equilíbrio. Para ser capaz de medir a fusão mitocondrial, é importante para a fotoativação apenas 10-20% da rede, de tal modo que a propagação do sinal para o resto da rede pode ser monitorizado ao longo do tempo. Se for muito grande parte da rede é fotoativados, é possível que a fusão completa irá ocorrer muito rapidamente, eo evento não será capturada.
Cuidado extremo deve ser levado paraajustar a potência do laser do laser de dois fotões, bem como a concentração TMRE para evitar fototoxicidade o que leva a despolarização mitocondrial. Garantir que o sinal mtPAGFP colocalizes com o sinal TMRE pode ajudar a avaliar a fototoxicidade e de saúde geral das células 8,15. Iluminação com luz epifluoerescent deve ser evitada. Embora a pesquisa de células que expressam mtPAGFP, o pinhole deve ser maximamente aberto durante a digitalização com uma excitação de baixa potência 488 nm. Ajustando a potência do laser de dois fotões para a fotoativação suficiente PA-GFP para medir o sinal ao longo de 1 hora, mas não para oversaturate qualquer uma das células pode ser complicado 8. Entretanto, o tempo deve ser gasto nesta etapa de otimização porque o programa uma vez automatizado é iniciado, ele é entediante para pará-lo, para escolher mais células, e currículo.
Para controle de qualidade, a aquisição de um contraste de interferência diferencial (DIC) imagem (ou luz transmitida) para monitorar o foco sobre as células podem ser muitoútil e também uma boa maneira de detectar bolhas formadas no óleo de imersão durante a digitalização, o que por vezes acontece a partir dos movimentos do palco.
Apesar de usar esse método mtPAGFP reúne dados sobre o movimento unidirecional de proteínas da matriz mitocondrial da mitocôndria fotoativado para aqueles que não estão rotulados, é concebível para utilizar esta técnica para estudar outros processos. Por exemplo, fluorocromos específicos pode ser ligado a proteínas de membrana para observar o seu movimento específico durante eventos de fusão, como foi mostrado para ABC-me, a fusão de que ocorre numa escala de tempo diferente a partir da mistura de proteínas da matriz solúveis 15.
Divulgações
Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Zeiss, Inc.
Agradecimentos
Agradecemos ao Centro Tufts para Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), a mitocôndria Affinity Pesquisa Colaborativa (mtARC), apoiado pelo Centro de Investigação Biomédica Evans Interdisciplinar da Universidade de Boston Medical Campus, Medicine Corporation Link, e Zeiss para apoiar este trabalho.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| COXIII-adenoviral PA-GFP | Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocal | Zeiss |
Referências
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Reimpressões e permissões
