Estabelecimento de Culturas Microbianas enriquecimento eucarióticas a partir de um quimicamente estratificada Antarctic Lake e Avaliação do Potencial de Fixação de Carbono

Resumo

Eucariontes microbianos são tanto uma fonte de carbono fotossinteticamente derivado e espécies maiores predadores em lagos permanentemente cobertas de gelo da Antártida. Este relatório descreve uma abordagem cultura enriquecimento para o isolamento metabolicamente eucariontes microbianos versáteis do lago da Antártida, Lago Bonney, e avalia potencial de fixação de carbono inorgânico através de um ensaio de radioisótopos para a ribulose-1 carboxilase oxigenase atividade ,5-bisphophate (Rubisco).

Resumo

Lago Bonney é um dos numerosos permanentemente cobertas de gelo lagos situados nos Vales Secos McMurdo, na Antártida. A cobertura de gelo perene mantém uma coluna de água quimicamente estratificada e ao contrário de outros corpos subterrâneos de água, em grande parte impede entrada externa de carbono e nutrientes em igarapés. Biota estão expostos a inúmeros estresses ambientais, incluindo o ano todo deficiência severa de nutrientes, baixas temperaturas, sombra extremo, hypersalinity, e 24 horas de escuridão durante o inverno ^1. Essas condições ambientais extremas limitar a biota no Lago Bonney quase que exclusivamente para os microorganismos ^2.

Eucariontes unicelulares microbiana (chamado "protistas") são jogadores importantes no ciclo biogeoquímico global ³ e desempenham papéis importantes ecológicos no ciclo do carbono nos lagos secos do vale, ocupando ambos os papéis primário e terciário da cadeia alimentar aquática. Nas secas vale alimentares aquáticas web, protistas que fixam inorganic carbono (autotrofia) são os principais produtores de carbono orgânico para os organismos organotrophic ^{4, 2.} Phagotrophic ou protistas heterotróficos capazes de ingerir bactérias e protistas menores agem como predadores de topo da cadeia alimentar ^5. Por último, uma proporção desconhecida da população protista é capaz de metabolismo mixotróficas combinado ^{6, 7.} Mixotrofia em protistas envolve a capacidade de combinar a capacidade fotossintética com a ingestão de microorganismos phagotrophic presas. Esta forma de mixotrofia difere do metabolismo mixotróficas em espécies bacterianas, que envolve geralmente a moléculas de captação dissolvidos de carbono. Existem actualmente isolados protistas muito poucos de permanentemente gelo-capped lagos polares, e os estudos de diversidade protista e ecologia neste ambiente extremo ter sido limitada ^{8, 4, 9, 10, 5.} Uma melhor compreensão da versatilidade metabólica protista no seco vale simples teia alimentar do lago irá auxiliar no desenvolvimento de modelos para o role de protistas no ciclo global do carbono.

Nós empregamos uma abordagem cultura enriquecimento para o isolamento protistas potencialmente fototróficas e mixotróficas do Lago Bonney. Profundidades na coluna d'água foram escolhidos com base na localização de produção primária maxima e filogenética protista diversidade ^{4, 11,} bem como a variabilidade nas principais fatores abióticos que afetam os modos protista tróficos: profundidades rasas são limitadas por nutrientes importantes, enquanto mais profundas profundidades de amostragem são limitados pela disponibilidade de luz. Além disso, as amostras de água do lago foram suplementados com vários tipos de meios de crescimento para promover o crescimento de uma variedade de organismos fototróficas.

RuBisCO catalisa o passo limitante na Calvin Benson Bassham (CBB) ciclo, o caminho mais importante pelo qual os organismos autotróficos fixar carbono inorgânico e carbono orgânico para fornecer níveis tróficos superiores em cadeias alimentares aquáticas e terrestres ^12. Neste estudo, we aplicado um ensaio radioisótopo modificado para amostras filtradas ¹³ para monitorar a atividade carboxilase máximo como um proxy para o potencial de fixação de carbono e versatilidade metabólica nas culturas de enriquecimento Lago Bonney.

Protocolo

1. Aquisição Amostra

1. Escolher e preparar o local de amostragem um dia antes da amostragem da coluna de água. Isso permitirá que as camadas estratificadas da coluna de água para reformar depois de perturbação devido à perfuração e gelo buraco de ponto de fusão. Identificar a localização do local de perfuração por GPS.
2. Para acessar a coluna de água, comece a perfuração de um buraco no gelo com uma broca de gelo Jiffy ligado a uma extensão de vôo de 4 polegadas e Jiffy bit de corte. Para evitar o congelamento da broca no furo, para tentar evitar a perfuração para dentro da água líquida por suspensão de perfuração aproximadamente 4-6 polegadas acima do topo da coluna de água.
3. O furo terá de ser alargada a partir de um diâmetro de 15 a 60 cm antes da amostragem. Isto é conseguido através da utilização de um aparelho de fusão furo (Modelo Hotsy) que circula polietilenoglicol aquecido através de um tubo de cobre. De fusão furo demora tipicamente até 18 horas.
4. Antes de amostragem da coluna de água, garantir que todos os equipamentos necessários e st amostravasos orage são montados no local de amostragem. Materiais de amostragem incluem: garrafa Niskin (capacidade L 5-10), Guincho com profundidade calibrado cabo, Messenger, frascos de amostras suficientes para cada profundidade de amostragem e coolers para transporte de amostras.
5. Comece a amostragem no início do dia (~ 5 horas), como filtragem de água do lago deve ser preenchido no dia da amostragem. Recolher amostras de água (1-5 L) de profundidades desejada (por este estudo: 6-M, 15-m e profundidades 18-M de amostragem, medidos a partir do nível da água piezométrica no furo de gelo), utilizando um amostrador Niskin ligado a um calibrado guincho mão. Para evitar distúrbios da coluna de água coletar profundidades rasas antes de mais profundas.
6. Armazene as amostras do lago em refrigeradores e transporte do local de amostra para o laboratório de campo, utilizando um trenó anexado a um ATV (veículo todo o terreno). As amostras devem ser processadas ou estabilizado (por exemplo: flash congelamento em nitrogênio líquido) no laboratório de campo de amostragem imediatamente seguinte.

2. Desenvolviment de culturas de enriquecimento

1. Para o cultivo de culturas de enriquecimento, Concentrado 0,5-1 L de água do lago em 47 mm 0,45 poros filtros de tamanho polietersulfona através de filtração suave (et al. ⁴ para eucarionte diversidade filogenética.
2. De transferência do filtro 50 para tubo Falcon mL estéril contendo ~ 20 mL de água do lago filtrada recolhidos a partir da profundidade de amostragem mesmo que o filtro. Suavemente lavar as células a partir do filtro, utilizando uma pipeta estéril.
3. Transferir a suspensão de célula para um frasco de cultura de 25 centímetros ² estéril célula. Adicionar água lago filtrada recolhidos a partir de cada amostra de profundidade para aumentar o volume da cultura para 45 mL. Configurar múltiplas repetições para cada profundidade de amostragem se enriquecimentos em diferentes meios de cultura são desejados.
4. Suplemento frascos de cultura com 50x ssoluções terile para uma concentração final de 1X dos seguintes meios de cultura: meio basal Bold, BG11 e F / 2. Se o cultivo de organismos mixotróficas é necessária, set-up dois vasos F/2-supplemented e adicionar 2-3 grãos de arroz estéril para um dos frascos.
5. Incubar frascos de cultura de a baixa temperatura (4 ° C) e baixa irradiância (20 umol fotões m ^-2 s ^-1) em um crescimento de temperatura controlada incubadora durante pelo menos 4 semanas na Antártida antes da transferência para o seu laboratório dos EUA. Se isolados são desejados, a placa 250 uL de cultura de enriquecimento em placas de agar contendo meio de crescimento adequadas, após 2 semanas de incubação.
6. Para embarque para os EUA, as culturas de enriquecimento de transferência para tubos estéreis de 50 mL de falcão. Exigência de pedido de transferência "não congelar" e "manter a calma" no transporte pedido. Enquanto o processo de transporte da Antártica é relativamente rápida (2 semanas por via aérea comercial) e altamente fiável, existe uma possibilidade de perda de órgão fastidiosoismos durante o processo de transporte. Assim, os pesquisadores podem querer preservar uma subamostra antes do envio para que a perda de algumas espécies durante o processo de envio pode ser avaliado.
7. Após a chegada, em os EUA, a transferência de 5 mL de cultura de enriquecimento em 45 mL de meio de crescimento apropriadas em um balão de Erlenmeyer de 125-mL estéril tapado com uma esponja estéril. Culturas de enriquecimento devem ser mantidos como culturas de pé em uma temperatura em câmara de crescimento controlado ambiental (câmara de crescimento diurna, VWR) a 4 ° C/20 fótons mmol m ^-2 s ^-1. As culturas deverão ser transferidos para meio fresco a cada 30 dias.

3. Extração de células Lysate de enriquecimentos filtradas

1. Filtro de 5 mL de cultura de enriquecimento em um de 25 mm de filtros Whatman GF / F utilizando filtro de vácuo suave (menos de 10 psi). O filtro pode ser armazenada durante várias semanas a -80 ° C antes do ensaio actividade RuBisCO.
2. Corte o filtro em seções 4-5 com uma tesoura de aço e estéreistransferir as peças com fórceps estéreis para um tubo de tampa de rosca 2 mL cheio 1/5 da maneira completamente com 0,1 mm de diâmetro de zircónio / sílica grânulos.
3. Adicionar 1,25 ml de tampão de extracção de filtro (50 bicina mM, MgCl2 10 _mM, EDTA 1 mM, 5 mg / mL de BSA, e 0,1% de triton X-100; adicionar fresco: 10 mM de _NaHCO3, 10 mM de DTT, 3,3 mM aminocapróico ácido, 0,7 mM de benzamidina, pH 7,8) ¹³ e perturbar células usando um batedor de Minibead três vezes por 30s na configuração de velocidade 48. Para evitar um aquecimento da amostra, beadbeating alternam com uma incubação de gelo min.
4. Centrifugar lama filtro durante 2 min a 3000 xg, a 4 ° C para formar uma pelota solta de GF / F fibras do filtro e os restos da parede celular.
5. Remover uma alíquota de 200 uL e imerso em 800 uL de gelo-acetona fria de 90%. Meça clorofila extraível (chl) um em um espectrofotômetro a valores de comprimento de onda de 664 nm e 647 nm ^14. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Centrifugar remaining sobrenadante a 4 ° C durante 2 min a 15.000 xg e transferir o sobrenadante (evitar o sedimento de membranas celulares insolúveis e restantes GF / F fibras do filtro) para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. Este lisado celular solúvel pode agora ser utilizado no ensaio de actividade carboxilase RuBisCO.
7. Lisado pode ser armazenado a -80 ° C após a adição de glicerol 12,5% e de congelação de flash em azoto líquido. Uma perda de actividade pode ocorrer depois de múltiplas de congelamento / descongelamento ciclos dependendo da sensibilidade das enzimas no lisado. Portanto, a atividade de lisado fresco contra congelado deve ser testada antes em grande escala de células lisado extrações.

4. RuBisCO Ensaio Filtro Carboxilase Atividade

1. Transferir 125 uL de lisado solúvel a um parafuso 15 mL tubo de microcentrífuga de tampão (tampão não necessário) que foi arrefecida em gelo. Para amostras de controlo negativo, adicionar 125 uL de lisado solúvel a 15 mL tubo de microcentrífuga com tampa de rosca, mas não se adicionar o substrato (no passo 4.7). Correrduplicar reacções para todas as amostras e controlos negativos.
2. Preparar 10 ml de tampão de ensaio fresco (50 mM bicina-NaOH, pH 8,0, 50 mM _NaHCO3, 25 _mM MgCl2) e frio em gelo. Alíquota suficiente do tampão de ensaio para todas as amostras e controlos negativos (100 uL por amostra / controlo mais 100 uL adicional) para um tubo de 5 ml. Execute todas as etapas subseqüentes sob uma coifa.
3. Adicionar 40 ul NaH ¹⁴ CO ₃ (500 uCi / mL) por mL de tampão de ensaio para o buffer de alíquota e manter o tampão em gelo.
4. Remover 10 uL de tampão de ensaio contendo ¹⁴ C e dilui-lo em 1 mL de tampão de ensaio. Após inversão de misturar, adicionar 100 uL da mistura de 1:100 diluída para 3 mL de Bio-Safe de cintilação II contando cocktail num frasco de cintilação. Inverta para misturar. Contagens de cintilação (Beckman LS6500) deve ser superior a 18.000 cpm, antes de continuar com o ensaio.
5. Quando uma quantidade suficiente NaH ¹⁴ CO ₃ foi adicionado ao tampão de ensaio,mover os tubos de reacção para um banho seco pré-definido para 25 ° C e incubar durante 3-5 minutos.
6. Adicionar 100 uL de tampão de ensaio para os lisados ​​e incubar durante 5 min a 25 ° C.
7. Adicionar 20 ul de 15 mM bifosfato Ribulose, para amostras e permitir que a reacção prosseguir durante 5-10 minutos a 25 ° C.
8. Adicionar 100 uL de ácido propiónico (100%) (Fisher) para parar a reacção. Centrifugar durante 1 hora a 2000 xg para esgotar unincorporated ¹⁴ C.
9. Transferir o volume total das amostras para frascos de cintilação contendo 3 ml Bio-Safe cocktail de cintilação II a contagem. Determinar cpm de produtos finais de ácido estáveis ​​por contagem de cintilação (B. Witte, R. comunicação Tabita pessoal).
10. Calcular as taxas de atividade da Rubisco em um chl uma base ^14.

5. Os resultados representativos

Utilizamos cultura enriquecimento para o isolamento fototrófico adaptadas ao frio e protistas mixotróficas que residem na Antártica Lake Bonney. Para capturar uma maior diversidade de organismos, testamos três meios de cultura tipos: meio basal Bold (BBM) ^15, F/2-Si Marinha média ^{16, 17} e BG11 Médio ^18. A inspecção visual das culturas de enriquecimento por microscopia de luz revelou que as culturas foram dominados por protistas fototróficas (indicado pela presença de pigmento de clorofila na maioria das células) e nutria uma variedade de morfologias de células, dependendo da profundidade de amostragem a partir do qual o inoculo foi tomada eo tipo de meios utilizados na cultura (Fig. 1).

Nós medimos as taxas máximas de atividade carboxilase catalisadas pela enzima RuBisCO como um proxy para o potencial de fixação de carbono. Abundância um Chl foi também monitorizada como uma estimativa da biomassa protista fototrófico (Fig. 2). Apesar de o cultivo de todas as culturas sob o regime de temperatura / luz mesmo (ou seja, 4 ° C/20 mmol m ^-2 s ^-1), o potencial de fixação de carbonoe biomassa fototrófico variou drasticamente entre as culturas de enriquecimento. Máxima actividade RuBisCO foi observada em culturas de enriquecimento de crescimento em qualquer BBM (enriquecimentos 4 e 6) ou BG11 (enriquecimentos 13 e 14) meios de crescimento, enquanto que as culturas enriquecidas em F / 2 meio de crescimento (enriquecimentos 19, 21, 23) exibiram uma 4 - a 34 vezes menor actividades carboxilase máximos. Estas diferenças não foram devido aos níveis mais baixos de biomassa nas culturas de F / 2, como a actividade carboxilase foi expressa numa base de uma Chl. Além disso, a actividade da RuBisCO não se correlacionou com a concentração de um chl (r = -0,023, p> 0,1;. Fig. 2, inserção). As culturas inoculadas com água BBM lago a partir de 6 e 15 m (enriquecimentos 4 e 5) apresentou o maior Chl a níveis, enquanto todas as outras culturas exibiram chl relativamente baixa um, independentemente da RuBisCO actividade da enzima (Fig. 2).

Figura 1.Representativos microbianas eucarióticas culturas de enriquecimento que tenham seleccionados para o crescimento de organismos diferentes. Identidade da cultura é dada no canto inferior esquerdo dos painéis. Todas as imagens representam micrografias luz gerada utilizando imersão em óleo e aumento de 1000x.

Figura 2. Capacidade de fixação potencial de carbono e de clorofila extraível um níveis em microbianas Antárctico culturas de enriquecimento eucarióticas isoladas de Lake Bonney e cultivadas em vários meios de cultura. Ver Tabela 1 para detalhes cultura Detalhe:. Correlação de Pearson entre clorofila a potencial de fixação de carbono em abundância e microbianos da Antártida culturas de enriquecimento eucarióticas.

Discussão

Estudos moleculares recentes têm relatado alta diversidade de unicelulares eucariontes através de uma variedade de ambientes ^{3, 19, 20,} no entanto, devido à falta de isolados em toda a gama de habitats protista os papéis funcionais dessas espécies individuais em teias alimentares são largamente desconhecido. Neste estudo, descrevemos metodologias para enriquecer de espécies microbianas eucariotos exibindo versatilidade metabólica de um ambiente relativamente undersampled, um permanentemente coberta de gelo da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
BBM	Sigma	B5282
BG11	Sigma	C3061
F / 2	Sigma	G9903
GF / F filtro, 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
GF / F filtro, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Polietersulfona de filtro, 0,45 mM de poro, 47 mm	Pall Life Sciences	61854
Frasco de cultura estéril célula, 25 cm 2	Corning	430639
Diurnal câmara de crescimento	VWR	35960-076
Zircônia / sílica contas, 0,1 milímetros diâmetro igual	Produtos BioSpec	11079101z
Mini-Bead batedor	Produtos BioSpec	3110BX
Tampa de rosca tubo de microcentrífuga (1,5 uL)	EUA Científico	1415-8700
NaH 14 CO 3	ViTrax	VC 194	Manter em alíquotas de 400 uL a -20 ° C
RuBP	Sigma	R0878-100mg	Dissolve-se em 10 mM Tris-ácido propiónico (pH 6,5)