Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.
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Artigo de método
Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A planária, um verme de água doce, tem provado ser um poderoso sistema para dissecar regeneração metazoários e haste 1,2 biologia celular. Regeneração planária de quaisquer tecidos danificados ou ausentes é tornada possível pelas células estaminais adultas denominado neoblasts 3. Embora essas células-tronco foram definitivamente demonstrou ser pluripotentes e singularmente capaz de reconstituição de um animal inteiro 4, a heterogeneidade dentro da população de células-tronco ea dinâmica de seus comportamentos celulares permanecem sem solução. Devido ao grande número e distribuição ampla de células-tronco ao longo do plano do corpo planária, métodos avançados para a manipulação de subpopulações de células estaminais para o estudo molecular e funcional in vivo são necessários.
Transplante de tecidos e irradiação parcial são dois métodos pelos quais uma subpopulação de células-tronco planária podem ser isoladas para estudo posterior. Cada técnica tem vantagens distintas. Ttransplante questão permite a introdução das células estaminais, num hospedeiro ingénuos, que são inerentemente qualquer geneticamente distintas ou que tenham sido previamente tratados farmacologicamente. Alternativamente, a irradiação parcial permite o isolamento de células-tronco dentro de um hospedeiro, justaposta ao tecido desprovido de células estaminais, sem a introdução de uma ferida ou qualquer culatra em integridade do tecido. Usando estes dois métodos, pode-se investigar os fatores celulares autónomos e não autónomos que controlam funções de células-tronco, tais como a proliferação, diferenciação e migração.
Tanto o tecido transplante 5,6 e irradiação parcial 7 têm sido usado historicamente na definição de muitas das questões sobre regeneração planária que permanecem em estudo hoje. No entanto, estas técnicas têm permanecido subutilizada devido à natureza trabalhoso e inconsistente de métodos anteriores. Os protocolos apresentados aqui representam um grande passo na diminuição do tempond esforço necessário para gerar reproduzível um grande número de animais enxertados ou parcialmente irradiada com eficácias que se aproximam de 100 por cento. Nós cobrimos a cultura de animais de grande porte, imobilização, a preparação para irradiação parcial, o transplante de tecidos, ea otimização da recuperação de animais. Além disso, o trabalho aqui descrito demonstra a primeira aplicação do método de irradiação parcial para uso com o planária mais amplamente estudados, Schmidtea mediterranea. Além disso, o tecido eficiente enxertia em planaria abre a porta para o teste funcional de subpopulações de células-tronco ingênuos ou tratados nos ensaios de repovoamento, que tem sido o método padrão-ouro de se avaliar o potencial das células-tronco adultas em mamíferos 8. A ampla adoção destas técnicas irá sem dúvida levar a uma melhor compreensão dos comportamentos celulares de células-tronco adultas durante a homeostase e regeneração tecidual.
Protocolo
Nota: este protocolo sugere a utilização de materiais potencialmente perigosos (chumbo e chloretone). Adquira, leia e siga FDS para todos os materiais potencialmente perigosos.
1. Cultura Animal, Seleção e Preparação
- Para a cultura animal e água manuseamento planária utilização (1X sais Montjuïc 9) e pipetas de transferência de plástico.
- Sexual biótipo Schmidtea mediterranea pode ser usado quando levantada no laboratório sob condições de cultura normal 10. Para produzir amostras de tamanho assexuadas requisito, S. mediterranea levantado à temperatura ambiente so....
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Discussão
Importância da imobilização
A imobilização é, de longe, o passo mais crítico para a conclusão com êxito de qualquer destes processos. Se planaria são indevidamente imobilizado antes da irradiação parcial, podem mover-se sob o escudo de chumbo, produzindo resultados inconsistentes e de confusão. Além disso, se os animais são insuficientemente imobilizada após o transplante, o verme hospedeiro provavelmente afastar-se do tecido do enxerto, o que resulta numa falha do enxerto para curar adequadame.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Chiyoko Kobayashi e Kiyokazu Agata para conselhos úteis sobre transplante planária, bem como membros do passado e do presente do laboratório Sánchez para discussões valiosas durante o desenvolvimento dessas técnicas. Este trabalho foi financiado pelo NIH Training Grant (5T32 HD0791) para OCG e R37GM057260 NIH para ASA. ASA é um Howard Hughes Medical Institute.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| General Purpose Transferência Pipetar | Samco | 691 | |
| Os tubos capilares (milímetros ID 0,75) | FHC | 30-30-0 | |
| Os tubos capilares (OD 0,7 mm) | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 | |
| Papel de filtro preto | Schleicher & Schuell | 10310809 | |
| Whatman n º 2 1002-055 papel de filtro | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman # 3 papel de filtro 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| Papel de cigarro rolando | Zig-Zag, original | NA | |
| Petripratos | VWR | 82050-544 | |
| Pinças DUMONT, INOX # 5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| Caseína | Sigma Aldrich | C3400 | |
| Chumbo Shields | Alfa Systems Corp, Bluffdale, UT | Design personalizado | |
| XRAD-320 Irradiador Biológica | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
Referências
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H.
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Reimpressões e permissões
