Caracterização de mecanismos moleculares de<em&gt; Em vivo</em&gt; RUV catarata induzida

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

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Caracterização de mecanismos moleculares de

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DOI:

10.3791/4016

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28 de novembro de 2012

Konstantin Galichanin¹^,² , Nooshin Talebizadeh² , Per Söderberg²

¹St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, ²Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

Neste artigo

Resumo

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo. Radiação solar ultravioleta (UVR) é o principal fator de risco para o desenvolvimento de catarata. Um modelo animal de longe RUV-B catarata induzida foi desenvolvido. Neste artigo vamos descrever os métodos de investigação de formação de catarata: a exposição a raios ultravioletas, RT-PCR e imuno-histoquímica.

Resumo

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo ^1. A Organização Mundial de Saúde define catarata como uma turvação da lente do olho, o que impede a transferência da luz. A catarata é uma doença multi-factorial associada com diabetes, o tabagismo, radiação ultravioleta (RUV), o álcool, a radiação ionizante, esteróides e hipertensão. Há evidências experimentais ^2-4 e epidemiológica forte que ^5,6 UVR provoca catarata. Foi desenvolvido um modelo animal para a RUV B catarata induzida em ambos com ⁷ anestesiados e não anestesiados animais ^8.

A única cura para a catarata é a cirurgia, mas este tratamento não é acessível a todos. Estimou-se que o atraso de aparecimento da catarata por 10 anos poderia reduzir a necessidade de cirurgia de catarata em 50% ^9. Para atrasar a incidência de catarata, que é necessária para compreender os mecanismos de formação de catarata e encontrar estratégia de prevenção eficazgias. Entre os mecanismos para o desenvolvimento de cataratas, a apoptose desempenha um papel crucial na iniciação da catarata em humanos e animais ^10. Nosso foco tem sido recentemente apoptose na lente como o mecanismo para o desenvolvimento de cataratas ^8,11,12. Prevê-se que uma melhor compreensão do efeito da radiação UV sobre a via de apoptose proporcionará possibilidades para a descoberta de novos fármacos para prevenir a catarata.

Neste artigo, nós descrevemos como catarata pode ser induzida experimentalmente pela exposição in vivo a RUV-B. Além disso RT-PCR e imuno-histoquímica estão apresentados como ferramentas para o estudo dos mecanismos moleculares de catarata induzida por radiação UV-B.

Protocolo

1. A exposição à radiação ultravioleta

15 min antes da exposição, anestesiar uma ratazana Sprague-Dawley do sexo feminino, com uma mistura de 90 mg / kg de Ketalar (cetamina), e 10 mg / kg de Rompun (xilazina) por injecção intraperitoneal.
Colocar o animal em um limitador de rato e apertar as correias até a imobilização do rato sem provocar um aperto do tronco ^13.
Instilar Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, em ambos os olhos dos ratos para induzir midríase.
Colocar o animal para que um olho está posicionado de encontro a um estreito feixe de RUV a 300 nm ¹⁴ nm com 10 largura total a metade do valor máximo e proteger o olho contralateral com fita adesiva preta.
Exponha o rato unilateralmente limiar sub-dose de 1 kJ / m ² RUV-B a 300 nm para 15 min ^15.

2. Dissecação

Após pré-determinado intervalo de pós-exposição (1, 5, 24 e 120 horas), o sacrifício do rato de seis semanas de idade (peso <200 g) por carbon asfixia e dióxido de deslocamento das vértebras cervicais.
Enuclear olhos. Depois disso, coloque a córnea do olho para baixo, lado posterior para cima. Em seguida, o perfurador de um furo através da aplicação de um mínimo de uma cânula de calibre 27 e empurre tangencialmente à esclerótica para evitar danificar a lente que é muito próximo da esclera. Em seguida, usar um par de tesouras de cirurgia oftálmica para cortar circunferencialmente logo atrás do limbo até que a porção posterior da esclerótica pode ser levantada. Depois, levante a lente com uma pinça sem corte curvas.
Remover restos do corpo ciliar do equador do cristalino sob um microscópio, mantendo a lente na solução de sal equilibrada de não mais do que 5-10 minutos.

3. RT-PCR quantitativa

Colocar uma lente em uma mistura de 350 ul de tampão de lise RA1 (NucleoSpin ARN II de ARN total isolado kit) e 3,5 ul de β-mercaptoetanol em 2 ml de tubo Eppendorf.
Manter a lente nesta mistura durante 30 min à temperatura ambiente.
Homogeneizar a lente comuma agulha até que apenas o núcleo duro do cristalino é deixada entre a lente (córtex e da cápsula da lente são lisadas em tampão de lise). Remover o núcleo a partir da mistura.
Armazenar as amostras imediatamente a -70 ° C.
Descongelar as amostras e seguir o protocolo "purificação RNA total a partir de células cultivadas e tecidos" (NucleoSpin RNA II RNA total isolamento kit).
Armazenar as amostras de ARN a -70 ° C.
Para verificar a remoção suficiente de DNA de cada amostra, execute uma PCR sob as seguintes condições (passo 1: 95 ° C durante 2 min; passo 2 durante 40 ciclos de: 95 ° C durante 20 segundos, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 20 segundos; passo 3: 72 ° C durante 7 min) com os iniciadores de ADN específicos de p53, para a frente 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'e inverso 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' e a Taq DNA polimerase (dNTPack), de acordo com a fabricação protocolo. O produto de PCR esperado é 243 pares de bases.
Executar uma electroforese em gel de agarose 1,5% para detectar ADN do produto de PCR específico de 243 pares de bases. Para preparar1,5% de agarose gel em tampão TBE ter 3,75 g de agarose e resolvê-lo em 250 ml de tampão TBE. Adicionar brometo de etídio (0,5 mg / ml) em 500 ul de 500 ml de solução a 1,5% de gel de agarose. Aquece-se a mistura num forno de microondas owen e agitar para resolver a agarose.

Nenhuma das amostras tem de revelar quaisquer produtos de PCR específicos de DNA em electroforese em gel de agarose a 1,5%.

Medir a concentração de amostras de RNA (1 ul) e a razão entre a absorvância da amostra a 260 nm (RNA) e 280 nm (de proteína) em um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop. Se o RNA relação à proteína de RNA absorvância da amostra é de 2,0 ou mais, em seguida, a amostra de RNA é puro. Se a razão de absorvância da amostra de RNA é menor do que 2,0, refazer o RNA etapa de purificação de 3,5.
Tomar um volume de amostra de ARN correspondente a 1 ug e sintetizar cDNA após a 1 ^ª Strand Kit protocolo de síntese de ADNc (1 ^st Strand Kit de síntese de ADNc por RT-PCR).
Armazenar as amostras de cDNA a -20 ° C(Por um período de um ou mais anos, armazenar a -70 ° C).
Executar quantitativa PCR em tempo real em iCycler única cor MyiQ Real Time sistema de detecção de PCR. Carga triplicados em placa de 96 poços com 1 ul da amostra de cDNA, TaqMan Gene Expression Mix Master, TaqMan Gene Expression Assay por caspase 3, de acordo com as instruções para a fabricação. Carga triplicados em outra placa de 96 poços com 1 ul da amostra de cDNA, TaqMan Gene Expression Mix Master, TaqMan Gene Expression Assay por 18s, de acordo com as instruções para a fabricação (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Diluir em série de uma fracção de cDNA a partir de três escolhidos aleatoriamente não expostas lentes. Executar diluições em série juntamente com o cDNA a partir de amostras em uma placa de 96 poços.
Utilizar o método de curva padrão para a quantificação dos resultados. O número de ciclos a fluorescência limiar é utilizado como a medida em software MyiQ. Uma curva padrão de expressar o número de ciclos de limiar como uma função da concentração relativa de calibrador é eslecido para as diluições em série em cada uma das placas. cDNA a partir de três amostras não tratadas foi de lente usada para calibração. Relacionar o número limite de ciclos para cada amostra com a curva padrão para se obter a concentração relativa da amostra de cDNA medido. Finalmente, obter o nível de expressão dos genes alvo através da relação entre a concentração relativa do alvo de cDNA para os 18s de controlo interno de cDNA.

4. A coloração imuno-histoquímica

Fixação
1. Dissecar o olho em PBS (Tampão fosfato salino, pH 7,4).
2. Colocar o olho em um tubo cheio com paraformaldeído a 4% (PFA) em frio de gelo durante 20 min. Prepare PFA 4% no dia anterior. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização. PFA é fresco por cerca de uma semana.
3. Remover PFA com uma micropipeta. Em seguida, lava-se com PBS arrefecido em gelo durante 20 min.
4. Colocar o olho em sacarose a 30%, a +4 ° C durante a noite.
5. Colocar o olho em um copo cheio de temperatura de corte ideal (outubro) e médio (Tissue-Tek). Colocar o olho em posição adequada para o corte.
6. Congelar em OCT médio sobre gelo seco.
7. Armazenar a -70 ° C até à sua utilização.
Seccionamento
1. Posicione o olho para crio-corte em um plano apropriado.
2. Corte três 5 mm de espessura médio-sagital secções de uma porção central de cada uma das lentes. Descartar pelo menos seis trechos entre seções seqüenciais para evitar manchar os mesmos núcleos em diferentes seções.
3. Uma vez que a seção tenha sido cortada, coloque delicadamente um slide em cima dela. A seção deve, então, ficar com o slide.
4. Deixar as lâminas secar ao ar antes da utilização. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C até serem necessárias.
Fluorescência imunohistoquímica
1. Deixe as amostras atingir a temperatura ambiente (5-10 min).
2. Desenhar bordas em torno dos espécimes com uma caneta PAP-(Invitrogen).
3. Deixe que a fronteira seco durante algum tempo (10 min).
4. Rotular as lâminas de microscópio.
5. Rehidratar em 1 × PBS durante 15 min.
6. Permeabilizar a solução padrão para bloco de 30 min.
7. Adicionar anticorpo primário (caspase-3 de coelho, policlonal de anticorpos clivados Asp175 9661; tecnologia de sinalização celular, Inc) diluída 1:3.000 em solução bloco padrão.
8. Armazenar numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite.
9. Lavar com PBS por pipetagem (3 x 5 min) ou por imersão num banho de grandes dimensões (> 15 min, 1-2 alterações).
10. Adicionar anticorpo secundário (anticorpo de coelho anti secundária com um espectro de absorção / emissão específico) diluído 1:300 em solução de bloqueio padrão.
11. Lavar com PBS por pipetagem (3 x 5 min) ou por imersão num banho de grandes dimensões (> 15 min, 1-2 alterações).
12. Limpe PAP pen-manchas.
13. Armazenar numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 3 hr. Evitar a exposição à luz.
14. Adicionar uma gota de Vectashield e colocar uma lamela sobre a lâmina. Evite fazer bolhas.
15. Deixe secar a camada Vectashield (~ 20 min).
16. Mantenha seções in no escuro até a análise.
17. Todas as secções de controlo são tratados, na ausência de anticorpo primário.
18. Olhe para os resultados dentro de algumas horas sob um microscópio de fluorescência.
19. Conte núcleos de células epiteliais "de um arco lateral nuclear para outro lado arco nuclear de cada lente. Aplicar o filtro padrão azul para ver todos os núcleos lente epitelial em azul e um filtro padrão que se encaixa a emissão do anticorpo secundário para ver os núcleos caspase-3 positiva em verde.
20. Registar o número de todos os núcleos lente epiteliais e o número de núcleos positivos. Conte as células três vezes para cada seção.