Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.
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Artigo de método
Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Existe um grande conjunto de provas indica que os novos neurónios funcionais são constitutivamente gerada a partir de um pool de endógena das células estaminais neurais em áreas restritas do cérebro de mamíferos adultos. Neuroblastos-nascidos da zona subventricular (SVZ) migram ao longo do córrego migratório rostral (RMS) para seu destino final no bulbo olfatório (OB) 1. No RMS, neuroblastos migram tangencialmente em cadeias ensheathed por processos astrocíticos 2,3 utilizando vasos sanguíneos como um suporte estrutural e de uma fonte de factores moleculares necessários para a migração de 4,5. No OB, neuroblastos destacar das cadeias e migram radialmente em diferentes camadas bulbares onde se diferenciam em interneurônios e integrar a rede existente 1, 6.
Neste artigo, descreve o procedimento para a migração de células de controlo em fatias agudas do cérebro de roedores. O uso de fatias agudas permite a assessment de migração celular no microambiente que se assemelha a condições in vivo e em regiões do cérebro que são de difícil acesso por imagem in vivo. Além disso, evita-se a cultura de longo condição, como no caso de culturas organotípicas célula e que pode, eventualmente, alteram as propriedades de migração das células. Precursores neuronais em fatias agudas podem ser visualizados usando óptica DIC ou proteínas fluorescentes. Rotulagem viral de precursores neuronais no SVZ, neuroblastos enxerto de ratos repórter no SVZ de ratinhos de tipo selvagem, e utilizando ratinhos transgénicos que expressam a proteína fluorescente em neuroblastos são todos os métodos adequados para a visualização de neuroblastos e na sequência da sua migração. O método mais tarde, no entanto, não permite que as células individuais a serem rastreados por longos períodos de tempo, devido à elevada densidade de células marcadas. Foi utilizado um microscópio de campo amplo fluorescente vertical equipado com uma câmara CCD para obter um intervalo de aquisição relativamente rápida (uma image cada 15 segundos, ou 30) para identificar com segurança as fases estacionária e migratórias. A identificação precisa da duração das fases estacionárias e migratório é crucial para a interpretação inequívoca dos resultados. Também realizamos várias z-passo aquisições para monitorar a migração neuroblastos em 3D. De campo amplo imagem fluorescente tem sido amplamente utilizado para a visualização de migração neuronal 7-10. Aqui, nós descrevemos protocolo detalhado para a marcação de neuroblastos, executando em tempo real de imagens de vídeo de migração dos neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior do rato adulto, e analisando a migração celular. Embora o protocolo descrito exemplificado a migração dos neuroblastos da RMS adulto, ele também pode ser usado para seguir a migração de células em cérebros embrionários e pós-natais cedo.
Protocolo
1. Rotulagem precursores neuronais
Neuroblastos podem ser visualizados utilizando ratinhos transgénicos que selectivamente expressam proteínas fluorescentes em neuroblastos (ie, Dcx-GFP, GAD67-GFP), por estereotaxicamente injectando partículas virais que codificam as proteínas fluorescentes na SVZ ou RMS, ou por enxerto de precursores neuronais de ratos repórter (ou seja, , Dcx-GFP, GAD67-GFP) no SVZ de ratinhos de tipo selvagem. Nós descrever o processo de enxertia e rotulagem viral de precursores neuronais.
A dissociação dos neuroblastos da SVZ de ratinhos repórter
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Discussão
O direccionamento correcto de precursores neuronais para as regiões do cérebro adequadas é um processo fundamental subjacente a montagem correcta e função dos circuitos neurais. A grande maioria das células migram durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal no cérebro apenas em poucas regiões, tais como o giro, OB denteado e cerebelo, o deslocamento neuronal ainda ocorre. Os mecanismos de orquestrar a migração de células no cérebro pós-natal, contudo, permanece pouco compreendido. O conhecimento dos mecanismos e v.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma Canadian Institutes of Health Research (CIHR) subvenção para ASJK foi parcialmente financiado por uma bolsa Université Laval. AS é o destinatário de uma Cátedra de Pesquisa do Canadá em neurogênese pós-natal.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Sacarose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI 2 x6H 2 O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH 2 PO 4 xH 2 O | EMD | SX0710-1 | |
| CACI 2 x2H 2 O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (solução 40x) | Sigma | G8769 | |
| Pyruvat de sódio | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Meio Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen / Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Cetamina / Xilazina | CDMV | 5230 | |
| Pipeta de Pasteur | VWR | 14672-380 | |
| 15 tubo cônico ml | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml tubo cónico | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Capilares de vidro (injecção estereotáxica) | WPI | 4878 | |
| Petróleo | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| Seringa 20 cc | VWR | SS-20L2 | |
| Placa de Petri | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Cola | Permabond | 910 | |
| 95% de O2 / 5% de CO 2 | Linde | 24068835 | |
| Lâmina | WPI | 501901 | |
| Malha de nylon | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifugador | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipeta extrator | Instrumento Sutter | P-97 | |
| Nanolitro injetor | WPI | B203MC4 | |
| Aparelho de injecção estereotáxica | WPI | 502900 | |
| Micro sistema de perfuração | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-campo do microscópio fluorescente | Olimpo | BX61WIF | |
| Câmera CCD | Fotometria | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet câmara de imagem | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1Series plataforma de aquecimento 20 | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Sistema de aquecimento | Warner Instruments | TC-344B | |
| Objetiva de imersão 40X água | Olimpo | 1-UM587 | |
| Objetiva de imersão 10X água | Olimpo | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
Referências
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. ....
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Reimpressões e permissões
