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1. Microtomia para as secções não coradas
- Configure o banho de água e micrótomo de parafina para microtomia como padrão. Use slides carregados positivamente e pré-label com o número de caso, região do pâncreas (amostra) eo número de slide. Colocar o bloco de parafina no mandril micrótomo com o rótulo da cassete no lado esquerdo.
- Siga os procedimentos normais, microtomia secção em bloco até que o tecido é uniformemente encontrada. Produzir uma fita de cortes seriados (4 mm de espessura, 3-6 dependendo do número de manchas iniciais necessários (ver Formulário Caso Submission, Apêndice 1)). Seções separadas na fita, pegue cada um em ordem, e local em lâminas com ordem numérica com o lápis. Denote se uma seção não é utilizada pela numeração seções na ordem exata. Manter a mesma orientação sobre a lâmina como encontrado no cassete com a etiqueta lâmina orientada para a esquerda. Secar durante a noite à temperatura ambiente, em seguida, prosseguir com a coloração ou de distribuição para os investigadores.
- Ressuperfície eal de bloco de parafina com fina camada de parafina para preservar o tecido e arquivar à temperatura ambiente ou -20 ° C.
- Para microtomia subseqüente, manter a numeração de secções seriadas a cada nível acima. Obter 1 slide adicional e mancha por slide H & E para cada nível mM ~ 100 dentro de cada bloco.
2. H & E Coloração
- Colocar a lâmina de série primeiro seccionados a partir de cada bloco em um porta-lâminas em seguida, na primeira bandeja na Autostainer.
- Selecione o programa H & E padrão de manchas e proceder como de costume.
- Quando terminar coloração, retire os slides de Autostainer e lugar na capa de lamínulas.
- Lamela utilizando a técnica padrão. Seque bem e rótulo com uma etiqueta impressa (ver secção 12).
3. IHC Set-up
- Selecione o programa Dako para manchas de casal e os números de entrada de slides. Preparar TBST e citrato de buffers, anticorpos, e Reag outroentos de acordo com volumes indicados (Tabela 1). Carregar o tabuleiro de reagente e as lâminas. A rotação do limpa e linhas de resíduos são programados de acordo com as recomendações do fabricante.
- Se a realização destes ensaios manualmente, preparar volumes estimados. Incubar as lâminas em câmara úmida para evitar lâminas secarem em qualquer etapa. Siga o mesmo procedimento para cada reagentes como quando usado para o Autostainer.
4. IHC desparafinização e recuperação de antígenos
- Colocar as lâminas em xileno durante 5 minutos. Repetir uma vez. Não permita que as lâminas para secar a qualquer momento subseqüente, até indicado como isso irá resultar em fundo excessivo e coloração pobres.
- Transferir as lâminas etanol a 100% durante 2 minutos. Repetir uma vez.
- Colocar as lâminas em recém-preparada de 3% de H2O 2 em metanol durante 10 minutos.
- Dip lâminas em etanol a 90% e, em seguida, colocar em etanol a 90% durante 3 minutos.
- Transferência desliza paraEtanol a 70% durante 1 minuto.
- Lavar as lâminas em água desionizada.
- Pré-aqueça o vapor e tampão de citrato em vapor durante 5 minutos.
- Adicionar as lâminas tampão citrato no vapor e de vapor durante 30 minutos.
- Transferir imediatamente as lâminas de água e segure até que desliza arrefecer à temperatura ambiente (~ 20 minutos).
- Transferir as lâminas para as prateleiras Dako Autostainer de acordo com mancha seqüência (Figura 1) e executar o programa de dupla marcação. As principais etapas do programa Autostainer são listados para que corridas manuais pode duplicar.
5. Primeiros anticorpos primários (Ki-67, CD3, pâncreas polipéptido)
- Bloquear as lâminas com solução Sniper durante 15 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Incubar as lâminas em anticorpo primário durante 30 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Incubar com Mach2 de cabra anti-rato (Ki-67) ou anti-coelho (CD3, polipéptido pancreático) de rábano (HRP) polímero para 30 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Aplicar 3,3 diaminobenzidina-tetrahidrocloreto (DAB) a slides durante 4 minutos. Lavar duas vezes com água.
- As lâminas incubadas com polipéptido pancreático são mantidas no Dako quando está a ser ensaiada concorrentemente e TBST utilizado para todos os passos subsequentes ao passo que os restantes lâminas são incubadas com o segundo conjunto de anticorpos primários. Alternativamente, para ensaios manuais, avance para a secção 6.
6. Segundo Anticorpos Primários (insulina, glucagon)
- Incubar as lâminas em Deeb por 20 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Bloco com soro de cabra normal a 10% em bloqueador avidina de 20% em TBST (insulina) ou Sniper (glucagon) em TBST durante 20 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Incubar com insulina ou anticorpo primário glucagon durante 15 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Insulina: incubar em biotinilado cabra, porco anti-guiné na diluição 1:300 por 30 minutos. Lavar duas vezes com TBST. Incubar com ve padrãoctor reagente ABC-AP por 30 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- O glucagon: incubar em tampão durante durante 30 minutos, seguido por anticorpo de cabra anti-rato de fosfatase alcalina (AP) de polímero durante 30 minutos. Lavar duas vezes com TBST.
- Enquanto as lâminas são incubadas em conjugados, aquecer o tampão de LPR à temperatura ambiente. Adicione 1 gota de líquido vermelho permanente (LPR) por 3 mL de tampão antes do uso imediato e coloque no Dako rack de reagente. Incubar as lâminas em LPC por 4 minutos. Lavar duas vezes com água.
- Incubar as lâminas em hematoxilina por 1 minuto. Lavar duas vezes com água.
- Incubar as lâminas em TBS pH 7,6 por 1 minuto. Lavar duas vezes com água.
- Descarregar slides da DAKO Autostainer.
- Imediatamente desidratar lâminas coradas para polipeptídeo pancreático. Para todas as lâminas coradas duplas, seco durante pelo menos 1 hora, em seguida, desidratar.
7. Desidratação
- Desliza lugar em etanol a 80% durante 1 minuto.
- Mergulhar as lâminas em etanol a 95%.
Segurar as lâminas em etanol a 95% durante 30 segundos. - Transferir as lâminas em etanol 100% e segure 1 minuto. Repita.
- Dip slides em xileno.
- Mantenha as lâminas em xilol durante 1 minuto. Repita.
- Imediatamente montar lamínulas em lâminas com cytoseal.
8. Rotulagem de slides
- Digite as informações de identificação do caso incluindo órgão e número do bloco, mancha, data e impressão. Número da seção Serial é opcional para as manchas de slides primeiros de cada bloco. Os níveis subseqüentes são indicados por numeração.
- Coloque etiquetas em slides.
9. Digitalização de slides
- Coloque lâminas coradas na bandeja do scanner e digitalizar de acordo com a instrumentação.
- Organize os slides por doador e tecido tipo (cabeça do pâncreas, o corpo, cauda, baço).
- Lâminas coradas Arquivo à temperatura ambiente e quaisquer lâminas restantes não coradas a -20 ° C até ser utilizado.
10. RepreseResultados ntative
Estes procedimentos de coloração foram desenvolvidas para a Rede JDRF para os doadores de órgãos do pâncreas com Diabetes (nPOD) apresentar a caracterização de base de parafina e frescos blocos congelados. Cada doador tem uma caracterização inicial realizada composta de manchar a 2 quarteirões de cada região do pâncreas (cabeça, corpo e cauda) e do baço (Figura 1, ver também ficha de inscrição caso, Anexo 1). A coloração H & E é conduzida usando um Autostainer programado como para uma instalação clínica com clínico-grade soluções utilizadas por toda parte. Como blocos adicionais dos doadores são seccionadas, cada um tem um slide tomadas para a H & E para mostrar morfologia do tecido. Quando os blocos são seccionados de novo, como para distribuição aos investigadores, os níveis mais profundos também terá lâminas colhidas para representante H e E lâminas para documentar a morfologia todo o bloco de tecido, bem como a numeração secções seriadas em cada nível. Lâminas coradas são rotulados comidentificação caso, a região do pâncreas, número do bloco, mancha e data (Figura 2) e digitalizado para o sistema de gestão de informação em linha patologia. Imagens representativas de um dador de controlo são apresentados na Figura 3 em ambas as ampliações de baixa e alta para mostrar os resultados esperados seguindo este procedimento. A lâmina com manchado polipéptido pancreático (D, H) foi ensaiada em um dia diferente com o ensaio realizado manualmente e mostra reduzida intensidade de coloração do contracorante hematoxilina. As diferenças na intensidade de coloração de anticorpos primários ou contracoloração entre os ensaios é para ser evitado particularmente se usando análise de imagem de outro modo desliza com requerer correcção de cor individual para atingir as áreas mesma célula ou contagens.
Cada laboratório deve esperar para otimizar as concentrações de anticorpos como o lote para lote variação e outros reagentes e condições podem afetar a intensidade da coloração e especificidade. Com a aquisição de novas reagents, procedimentos de coloração são validados com conhecidos amostras de controlo positivo e negativo para atingir o mesmo grau de intensidade de manchas como com os reagentes anteriores. Anticorpos adicionais optimizados no núcleo patologia nPOD são fornecidos na Tabela 2, tal como uma fonte de referência e têm sido utilizados para multilabeling imunofluorescência para microscopia confocal.
Figura 1. Dako grade de coloração. Este esquemática descreve uma análise de rotina a partir de um dador pâncreas nPOD realizada num Autostainer Dako. Os doadores de nPOD são codificados com um número de identificação de 4 dígitos. Duas bandejas de slides são apresentados com slides organizados pela mancha. Configurações de deslizamento alternados são esperados dependendo do número de lâminas de doadores. Os controlos positivos incluem inclusão de um dador positivo conhecido para os dois manchas duplas e baço doador para o Ki-67 e CD3. Os controlos negativos são duplas e incluem duas slides de um bloco de pâncreas doador incubadas com imunoglobulina (Ig) a partir das espécies hospedeiras dos anticorpos primários e duas lâminas de baço dador para a insulina e glucagon.
Figura 2. Lâmina dupla representante manchado. Um slide acabado típico é mostrado com os parâmetros de slides de rotulagem e colocação de tecido antes de escaneamento digital é realizada.
Figura 3. Representante H & E e manchas IHC em seções pancreáticas. Seções do pâncreas de um doador de órgãos da fêmea adulta (6096-04 Panhead) foram coradas e scans digitais realizados conforme descrito no protocolo. As imagens foram obtidas usando o programa ImageScope visualização de toda a secção (AD) e de um ilhéu (EH). As intensidades das ilhotas esperados mancha para a insulina, glucagon e polipéptido pancreático sãoobservado para as secções BD como delineia secção D que este bloco cabeça do pâncreas contém uma pequena porção da região uncinado ou lóbulo ventral do pâncreas como todos os ilhéus pancreáticos contêm principalmente polipéptido células positivas. Note-se que a contracoloração de hematoxilina no painel D é muito leve, enquanto a contracoloração de hematoxilina intensidades em B e C são ideais. Painéis EH mostram um ilhéu do lóbulo dorsal com a distribuição esperada de células beta e α-células. A poucas células pancreáticas polipeptídicas são encontrados na porção inferior esquerdo da ilhota (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 insulina +; C, G-CD3 + glucagon; D, H pâncreas-polipéptido. AD, 0.2x, EH-12.8x.