Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H & E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H & E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.
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Artigo de método
Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As estimativas de área de ilhotas e os números e composição endócrino célula no pâncreas humano adulto variar de várias centenas de milhar a gamas de massa vários milhões e beta de 500 a 1500 mg 1-3. Com essa heterogeneidade conhecido, um tratamento padrão e procedimento de coloração foi desenvolvido para que as regiões pancreáticas foram claramente definidos e ilhotas caracterizados por histopatologia rigorosa e exames imunolocalização.
Procedimentos padronizados para o processamento de pâncreas humano recuperado de doadores de órgãos são descritos na parte 1 desta série. O pâncreas é processado em 3 regiões principais (cabeça, corpo, cauda), seguido de cortes transversais. Secções transversais da cabeça do pâncreas são ainda divididas, tal como indicado com base no tamanho, e numerados em ordem alfabética para denotar subsecções. Esta normalização permite uma análise completa transversal em corte da região da cabeça, incluindo a região que contém uncinado ilhotas compostosprincipalmente de células pancreáticas polipéptido para a região da cauda.
O presente relatório compreende parte 2 desta série e descreve os procedimentos utilizados para cortes seriados e caracterização histopatológica das seções pancreáticas de parafina com ênfase em células endócrinas das ilhotas, replicação e de células T infiltrados. Patologia de secções pancreáticas destina-se a caracterizar tanto exócrino, ductular, e componentes endócrinos. O compartimento exócrino é avaliada quanto à presença de pancreatite (activo ou crónica), atrofia, fibrose, e gordura, bem como o sistema de condutas, particularmente em relação à presença de neoplasia pancreática intraductal 4. Ilhotas são avaliadas para a morfologia, tamanho e densidade, células endócrinas, inflamação, fibrose, amilóide, bem como a presença de células replicantes ou apoptótico utilizando H e E e as manchas de IHC.
O componente final descrito na parte 2 é o fornecimento da lâmina coradas como digitalizados imagens de diapositivos inteiras. Os slides digitalizados são organizados por caso e região do pâncreas em um banco de dados on-line patologia criar um biobanco virtual. O acesso a esta coleção on-line está actualmente previsto para mais de 200 médicos e cientistas envolvidos na pesquisa do diabetes tipo 1. O banco de dados on-line fornece um meio para a rápida e completa partilha de dados e para os investigadores para selecionar blocos de parafina ou congelados cortes seriados.
Protocolo
1. Microtomia para as secções não coradas
- Configure o banho de água e micrótomo de parafina para microtomia como padrão. Use slides carregados positivamente e pré-label com o número de caso, região do pâncreas (amostra) eo número de slide. Colocar o bloco de parafina no mandril micrótomo com o rótulo da cassete no lado esquerdo.
- Siga os procedimentos normais, microtomia secção em bloco até que o tecido é uniformemente encontrada. Produzir uma fita de cortes seriados (4 mm de espessura, 3-6 dependendo do número de manchas iniciais necessários (ver Formulário Caso Submission, Apêndice 1)). Seções separadas na fita, pegue cada um em....
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Discussão
Padronização da IHC procedimentos é crítica para a análise de imagem, especialmente quando se utiliza algoritmos baseados em computador através de um grande número de lâminas ao longo do tempo. O processo de coloração IHQ descritos neste relatório permitirá a análise do lote de amostras de um doador dado, utilizando um Autostainer dentro de um dia de trabalho de 8 horas e são modificadas a partir de um relatório anterior 5. Digitalizadas imagens de slides inteiros de cada slide manchado disponibilizados para .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores agradecem as famílias dos doadores e as Organizações de Procura de Órgãos envolvidos na pesquisa e Montgomery Emily, Pietras Robert, Fu Ann, Agarwal Mitali, e Agarwal Roshan para a sua assistência especializada. Este trabalho foi financiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) em apoio da Rede de Doadores de Órgãos do pâncreas com Diabetes.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Peróxido de hidrogénio a 30% (H 2 O 2) | FisherScientific | H325-500 | A peroxidase endógena de bloqueio |
| ABC-fosfatase alcalina (AP) | Vetor | AK-5000 | AP conjugado |
| Diluente anticorpo | Invitrogen | 003218 | O anticorpo primário |
| Avidina bloqueador | Vetor | SP-2001 | Bloquear biotina endógena |
| Biotinilado de cabra anti-porco da guiné | Vetor | BA-7000 | Anticorpo secundário |
| Bluing Reagente | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Tampão citrato, pH 6,0 | Biogenex | HK086-9K | Recuperação antigênica |
| Clarificador 1 | FisherScientific | 7401 | Leica Autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Lamela de montagem |
| DAB | Vetor | SK-4100 | HRP cromógeno |
| Deeb | DAKO | S2003 | AP endógena bloqueando reagente |
| Eosina Y alcoólica | FisherScientific | 71204 | Leica Autostainer |
| Etanóis-100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Vário | Desparafinização e lamínulas |
| Hematoxilina | DAKO | S3301 | Dako Autostainer |
| Hematoxilina 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica Autostainer |
| IgG (todas as espécies de hospedeiros para os anticorpos primários) | Vário | Vário | Os controlos negativos para primárias |
| Líquido vermelho permanente (LPR) | DAKO | K0640 | AP cromógeno |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Cabra anti-rato conjugado AP |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Cabra anti-ratinho HRP |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Cabra anti-ratinho HRP |
| Metanol | FisherScientific | Vário | H 2 O 2 diluente |
| Soro de cabra normal | Vetor | S-1000 | IHC reagente bloqueador |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC reagente bloqueador |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC tampão |
| Trilogia 20x | Marque celular | 920p-06 | Recuperação antigênica |
| Xileno | FisherScientific | Vário | Desparafinização e lamínulas |
Tabela 1. Reagentes específicos.
| O anticorpo primário | Espécies hospedeiras | Vendedor | Cat. # | Comentários e recuperação de antígenos |
|---|---|---|---|---|
| Parafina | ||||
| Amilase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrato |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrato |
| A anidrase carbónica 19,9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, clivado | Coelho | Sinalização celular | 9961 | Citrato ou Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrato ou Trilogy |
| CD3 | Coelho | DAKO | A0452 | Citrato |
| CD34 | Mouse | Sinalização celular | 3569 | Citrato |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrato |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrato |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrato |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrato |
| Cromogranina A | Coelho | DAKO | A0430 | Citrato |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrato |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrato |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrato |
| C-péptido | Coelho | Sinalização celular | 4593 | Citrato |
| Foxp3 | Rato | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrato |
| A grelina | Cabra | Santa Cruz | SC-10386 | |
| A grelina | Coelho | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Coelho | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrato |
| Glucagon | Cobaia | Bachem | T-5037 | Citrato |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogia |
| Glut-2 | Coelho | Santa Cruz | SC-9117 | Não expressa em ilhotas humanas |
| Insulina | Cobaia | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrato |
| Mafa | Coelho | Novus Biológica | NB400-137A | Trilogia |
| Polipeptídeo pancreático | Coelho | Invitrogen | 18-0043 | Citrato |
| PDX-1 | Cobaia | Abcam | ab47308 | Citrato ou Trilogy |
| Proinsulina | Mouse | Novocastra | NCL-Proin-1G4 | |
| Proinsulina | Mouse | Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Banco | GS-9A8 | Citrato |
| Secretagogin | Coelho | Sigma | HPA 006641 | Citrato |
| Actina de músculo liso | Coelho | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatina | Coelho | DAKO | A0566 | |
| Sinaptofisina | Mouse | DAKO | M0776 | Citrato |
| Fresco Congelado | Espécies hospedeiras | Vendedor | Cat. # | Comentários |
| CD11b | Rato | Abcam | ab6332 | Fixe com PF 4% |
| CD11c | Coelho | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biológica | NB 600-564 | Use incubação durante a noite para parafina |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fixar-se com acetona |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130.569 | Fixe com PF 4% |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fixar-se com acetona ou PF 4% |
Tabela 2. Anticorpos primários.
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Scanner de slides Digital | |
| Além disso DAKO Autostainer | DAKO | Manchas IHC | |
| Etiqueta software de impressão Matrix | BioCarta | LM7UP57 | Software de etiqueta de slides |
| Leica XL Autostainer | Leica | H & E manchas | |
| Prêmio lamela | FisherScientific | 12-548-5J | Lamela |
| Information Manager Spectrum | Aperio | Software do scanner | |
| Além disso Superfrost desliza | FisherScientific | 12-550-15 | Lâminas carregadas positivamente |
| Vapor vegetal | Black e Decker | Vário | Recuperação antigênica |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Impressora de etiquetas de slides |
Tabela 3. Suprimentos e equipamentos específicos.
Referências
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
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Reimpressões e permissões
