Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Resumo

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

Resumo

Grande tamanho e desenvolvimento externo do embrião de galinha há muito tempo tornou uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento da técnicas da biologia molecular, a garota tornou-se um sistema útil para se estudar a regulação do gene e função. Por electroporating construções de DNA ou RNA no embrião de galinha em desenvolvimento, os genes podem ser expressos ou derrubado a fim de analisar in vivo a função do gene. Da mesma forma, constrói repórter pode ser usado para o mapeamento de destino ou para analisar elementos gene putativo de regulamentação. Comparação com experiências similares em mouse, eletroporação pintinho tem a vantagem de ser rápido, fácil e barato. Este vídeo demonstra como fazer primeiro uma janela na casca de ovo para manipular o embrião. Em seguida, o embrião é visualizado com uma solução diluída de nanquim injetado abaixo do embrião. Uma agulha de vidro e pipetas são utilizadas para injetar DNA e corante verde rápido dentro do tubo neural em desenvolvimento, em seguida, são colocados eletrodos de platina paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. Finalmente, o ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Além disso, o vídeo mostra a estocagem e manuseio apropriado e discute as possíveis causas do embrião eletroporação seguintes perda.

Protocolo

Manipulação de ovos

1. Os ovos podem ser conservados a 13 ° C por até uma semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade (um refrigerador do vinho pequeno é ideal para esta finalidade).
2. Antes da incubação, ovos para permitir que a temperatura ambiente, em seguida, coloque em uma galinha umidificado incubadora definido para 37,8 ° C (100 ° F).
3. Nós geralmente electroporate embriões aproximadamente 48 horas depois do início de incubação, quando o embrião atingiu Hamburger e Hamilton estágio 10.
4. Tempo de incubação pode variar de acordo com Hamburger desejado e estágio Hamilton. Temperatura é crítica e desvio da temp....

Discussão

Este protocolo fornece um guia passo a passo para eletroporação do tubo neural de embriões de galinha HH10. Além de mostrar a técnica, as diretrizes para o armazenamento e manuseio de ovos também é fornecido. Esta técnica tem uma ampla gama de aplicações para análise genética e do custo baixo e facilidade de experimentos torna viável para muitos laboratórios.

....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora para ovos de galinha			umidificada, ajustada para 37,80°C (100F).
Gerador de pulsos	Genetronics	BTX T820	Gerador de onda quadrada ou equivalente
Eletrodos			nossos eletrodos foram feitos com fio de platina de 0,25 mm de diâmetro, com 5 mm de comprimento e espaçados 1 mm entre si
Cabos de conexão
Micromanipulador
Lupa estereoscópica			com grande distância de trabalho
Capilares de vidro			e puxador de capilares ou agulhas de vidro comerciais
Meio Leibovitz’s L-15
Ovos de galinha			fertilizados
Tesoura curva
Seringa de 10 ml
Agulha de grande calibre			16-18G
Pipeta de boca
Tinta da Índia
Seringa de insulina/siringa
Plasmídeo de DNA			≥ 1μg/μl em TE estéril ou PBS 1X contendo 0,05% de corante Fast Green