Artigo de método

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

DOI:

10.3791/409

⸱

1 de novembro de 2007

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

Neste artigo

Resumo

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Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.

Resumo

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Isolamento de células a partir da fonte primária é um passo necessário em muitos protocolos mais complexos. Miltenyi oferece kits para isolar as células de vários organismos, incluindo seres humanos, primatas não-humanos, ratos e, como descrevemos aqui, camundongos. Separação magnética de células baseado em grânulos permite tanto a seleção positiva (ou depleção de células), bem como seleção negativa. Aqui, demonstramos seleção negativa de CD4 ve intocadas ou nd + células T helper. Usando este protocolo padrão que normalmente purificar as células que estão ≥ 96% CD4 pura + / CD3 +. Este protocolo é usado em conjunto com a dissecação de protocolo e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em camundongos publicado na edição de 7 de Jove, para purificação de células T e outros tipos de células para adotivamente transferência para fins de imagem. Embora nós não demonstramos análise FACS neste vídeo de protocolo, é altamente recomendável para verificar a pureza total de células isoladas usando os anticorpos adequados via FACS. Além disso, demonstramos o método não-estéril de isolamento de células T. Se as células estéreis são necessários para o seu aplicativo do usuário final particular, não se esqueça de fazer todos os procedimentos demonstrado na capa de cultura de tecidos sob condições padrão estéril. Obrigado por assistir e boa sorte com suas próprias experiências!

Protocolo

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Por favor, leia e siga o protocolo incluído no kit Miltenyi ou online em http://www.miltenyibiotec.com/ .

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Discussão

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Isolamento de células a partir da fonte primária é um passo necessário em muitos protocolos mais complexos. Miltenyi oferece kits para isolar as células de vários organismos, incluindo seres humanos, primatas não-humanos, ratos e, como descrevemos aqui, camundongos. Separação magnética de células baseado em grânulos permite tanto a seleção positiva (ou depleção de células), bem como seleção negativa. Aqui, demonstramos seleção negativa de CD4 ve intocadas ou nd + células T helper. Usando este protocolo padrão que normalmente purificar as cé...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

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Queremos agradecer Rebecca Paquett para a preparação de tampão MACS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tampão MACSReagenteNenhumNenhumPreparar conforme descrito pela Miltenyi.
Kit de Isolamento de Células T CD4+: Isolamento Não TocadoReagenteMiltenyi Biotec130-090-860Para uso com o sistema Miltenyi.
Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) EsterilizadaReagentePara uso no preparo do tampão MACS.
Placa de Cultura de 35 mm da Corning, Não Tratada para Adesão Celular (TC)OutroCorning430588Utilizada no preparo de uma suspensão de células únicas.
Peneira Celular de 70 mícronsFerramentaBD Biosciences352350Utilizada no preparo de uma suspensão de células únicas.
Seringa de 6 mLFerramentaTyco Healthcare, Covidien8881516051Utilizada no preparo de uma suspensão de células únicas.
Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco’s 10x (DPBS)ReagenteInvitrogen14200-075Para uso na lise de hemácias.
Água EsterilizadaReagenteSigma-AldrichW4502Para uso na lise de hemácias.

Referências

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  1. Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
  2. Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).

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