Summary
Isolering av lymfocyter med Miltenyi MACs kit är ett pålitligt sätt att rena celler från hela lymfatisk vävnad homogenat. Celler renas med hjälp av Miltenyi systemet är vanligen ≥ 96% ren. Här visar vi vilka åtgärder som vidtagits för att isolera CD4 + T-celler, en av de många satser som erbjuds av Miltenyi.
Abstract
Isolering av celler från den primära källan är ett nödvändigt steg i många mer komplexa protokoll. Miltenyi offers kit att isolera celler från flera olika organismer, inklusive människor, icke-mänskliga primater, råtta och som vi beskriver här, möss. Magnetisk pärla-baserade cellseparation tillåter antingen positiv selektion (eller cellbristen) samt negativt urval. Här visar vi negativt urval av orörda eller Na har CD4 + hjälpar T-celler. Med denna standardprotokoll vi normalt renar celler som är ≥ 96% ren CD4 + / CD3 +. Det här protokollet används tillsammans med det protokoll Dissection och 2-Photon Imaging för perifera lymfkörtlar på möss publicerades i nummer 7 av Jove, för rening av T-celler och andra typer cell till adoptively överföring för avbildning ändamål. Även om vi inte visade FACS analys i detta protokoll videon, är det starkt rekommenderas att kontrollera den totala renheten i isolerade celler med hjälp av lämpliga antikroppar via FACS. Dessutom visar vi den icke-steril metod för T-cell isolering. Om sterila celler behövs för just din tillämpning hos slutanvändarna, se till att göra allt de visat förfaranden inom vävnadsodling huven under normala sterila förhållanden. Tack för att titta på och lycka till med dina egna experiment!
Protocol
Läs och följ protokoll som ingår i Miltenyi kit eller online på http://www.miltenyibiotec.com/ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering av celler från den primära källan är ett nödvändigt steg i många mer komplexa protokoll. Miltenyi offers kit att isolera celler från flera olika organismer, inklusive människor, icke-mänskliga primater, råtta och som vi beskriver här, möss. Magnetisk pärla-baserade cellseparation tillåter antingen positiv selektion (eller cellbristen) samt negativt urval. Här visar vi negativt urval av orörda eller Na har CD4 + hjälpar T-celler. Med denna standardprotokoll vi normalt renar celler som är ≥ 96% ren CD4 + / CD3 +. Även om vi inte visade FACS analys i detta protokoll videon, är det starkt rekommenderas att kontrollera den totala renheten i isolerade celler med hjälp av lämpliga antikroppar via FACS. Dessutom visar vi den icke-steril metod för T-cell isolering. Om sterila celler behövs för just din tillämpning hos slutanvändarna, se till att göra allt de visat förfaranden inom vävnadsodling huven under normala sterila förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Rebecca Paquett för beredning av MACS buffert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
