Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Resumo

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução em C. elegans, Permitindo que centenas de sinapses para ser rapidamente caracterizados dentro de uma única amostra, sem distorções introduzidas pela z-plano de projecção.

Resumo

Força Synapse refere-se à amplitude das respostas pós-sinápticos para eventos de liberação de neurotransmissores pré-sinápticos, e tem um grande impacto na função circuito neural global. Synapse força crítica depende da abundância de receptores de neurotransmissores agrupadas em sítios sinápticos na membrana pós-sináptica. Níveis de receptores são estabelecidos developmentally, e pode ser alterada por tráfico entre pools receptor de superfície localizada, subsináptica, e intracelular, que representam importantes mecanismos de plasticidade sináptica e neuromodulação. Métodos rigorosos para quantificar sinapticamente localizada abundância receptor neurotransmissor são essenciais para estudar o desenvolvimento e plasticidade sináptica. A microscopia de fluorescência é uma abordagem ideal porque preserva informação espacial, distinguindo sináptica de não-sinápticos piscinas e discriminar entre as populações de receptores localizados em diferentes tipos de sinapses. A genética organismo modelo Caenorhabditis elegans é particularmente bem adequado para estes estudos, devido ao pequeno tamanho e simplicidade relativa do seu sistema nervoso, a sua transparência, e da disponibilidade de poderosas técnicas genéticas, permitindo o exame das sinapses nativas em animais intactos.

Aqui apresentamos um método de quantificação fluorescente-etiquetados receptores de neurotransmissores sinápticos em C. elegans. Sua característica fundamental é a identificação automatizada e análise individual das sinapses em três dimensões no plano multi-arquivos microscópio confocal de saída, a posição de tabulação, volume, intensidade de fluorescência, fluorescência e total para cada sinapse. Esta abordagem tem duas vantagens principais sobre a análise manual de z-plano projeções de dados confocal. Primeiro, porque todos os planos do conjunto de dados confocal está incluído, não existem dados são perdidos devido a z-plano de projeção, normalmente com base nas médias de intensidade de pixel ou maxima. Identificação, segundo as sinapses é automatizado, mas pode ser inspecionado pelo experimenter como o produto de análise de dados, permitindo a extração rápida e precisa dos dados de um grande número de sinapses. Centenas de milhares de sinapses por amostra pode ser facilmente obtida, produzindo grandes conjuntos de dados para maximizar a potência estatística. Considerações para a preparação de C. elegans para análise, e realizando imagem confocal para minimizar a variabilidade entre os animais nos grupos de tratamento são também discutidos. Embora tenha sido desenvolvido para analisar C. receptores pós-sinápticos elegans, este método é geralmente útil para qualquer tipo de sinapticamente localizada proteína, ou, na verdade, qualquer sinal de fluorescência que está localizada a aglomerados discretas, puncta, ou organelos.

O procedimento é realizado em três passos: 1) preparação de amostras, 2) imagem confocal, e 3) análise de imagem. Passos 1 e 2 são específicos para C. elegans, enquanto o passo 3 é geralmente aplicável a qualquer sinal de fluorescência em ponteada micrografias confocal.

Protocolo

1. Preparação de Worms para imagem

Este segmento do protocolo é baseada em trabalhos C. técnicas de cultura de elegans ^1,2, e é descrito na Figura 1.

1. Crescer vermes em alta peptona placas de ágar NGM (10 cm) semeados com NA22 E. bactéria Escherichia até quase morrer de fome. Se imunomarcação, uma placa irá produzir de forma confiável vermes suficientes para um indivíduo mancha, tendo em conta as perdas ao longo do caminho, e os rigorosos critérios utilizados para selecionar os vermes para geração de imagens (ver Parte 2).
2. Vermes colheita vertendo alguns m....

Discussão

O método aqui apresentado é projetado para extrair quantitativos múltiplos parâmetros de dados para grandes populações de sinapses em C. elegans, enquanto maximiza a consistência dentro de grupos de tratamento. Três características contribuir para estes objectivos. Em primeiro lugar, imunocoloração é realizada em populações de vermes síncronas para assegurar que todos os animais são da mesma idade. Este passo é crítico porque regulação do desenvolvimento de níveis de expressão podem obscurecer efeitos do tratam.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do software	Companhia		Comentários (opcional)
Volocity v4.0 ou superior	PerkinElmer / Improvision		Verifique sua instalação núcleo local de imagem para o acesso a este software. O software de demonstração está disponível no site da PerkinElmer. Este método requer apenas o módulo A determinação quantitativa de Volocity.
			Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos.
			Buffer de ovo NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Ajustar o pH a 7,3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Hipoclorito alcalino (por 5 ml) Lixívia fresca (descartar garrafa de 30 dias após a abertura) 10 N NaOH ddH2O 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml
			Tabela 1. Solutions.