Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

Resumo

Este artigo descreve um método para o isolamento e purificação de intacta Legionella Contendo vacúolos (VCL) da ameba e macrófagos. O protocolo de dois passos compreende enriquecimento LCV por imuno-magnético de separação utilizando um anticorpo contra um marcador LCV bacteriana e mais purificação por centrifugação em gradiente de densidade.

Resumo

O patógeno oportunista Legionella pneumophila é uma bactéria resistente à ameba, que também replica em macrófagos alveolares, assim causando o grave pneumonia "Legionários doença '" ^1. Em fagócitos protozoários e de mamíferos, L. pneumophila emprega um mecanismo conservado para formar um específico, compartimento de replicação permissiva, a "Legionella contendo vacúolo" (LCV). Formação requer a LCV bacteriana Icm / Dot tipo de sistema de secreção IV (T4SS), que transloca tantos como 275 "" efectoras proteínas em células hospedeiras. Os efetores manipular proteínas do hospedeiro, bem como lipídios e se comunicar com secreção, organelas endossômicas e mitocondrial ^2-4.

A formação de LCVs representa um processo complexo, robusto e redundante, que é difícil de agarrar de uma maneira redutora. Uma abordagem integrativa é necessária para compreender a formação abrangente LCV, incluindo uma análise global do caminhoOgen-host as interações e sua dinâmica temporal e espacial. Como um primeiro passo para este objetivo, LCVs intactos são purificados e analisados ​​por proteômica e lipidomics.

A composição e formação de vacúolos contendo agente patogénico foi investigado por análise proteômica utilizando cromatografia líquida ou 2-D de electroforese em gel acoplado a espectrometria de massa. Vacúolos isolados, quer social discoideum a ameba Dictyostelium solo ou fagócitos mamíferos abrigou Leishmania ^{5, 6} Listeria, Mycobacterium ^7, Rhodococcus ^{8, 9} ou Salmonella Legionella spp. ^10. No entanto, os protocolos de purificação utilizados nestes estudos são demorados e tedioso, em que requerem microscopia electrónica por exemplo, para analisar LCV morfologia, integridade e pureza. Além disso, estes protocolos não exploram características específicas do vacúolo patógeno para enrichment.

O método aqui apresentado supera essas limitações, empregando D. discoideum produzir um marcador fluorescente e LCV por alvo a proteína bacteriana SIDC efectora, que selectivamente âncoras para a membrana LCV ligando-se à fosfatidilinositol 4-fosfato (PtdIns (4) P) ^3,11. LCVs são enriquecidos num primeiro passo por imuno-magnético de separação utilizando um anticorpo de afinidade purificada primária contra SIDC e um anticorpo secundário acoplado a esferas magnéticas, seguido de uma segunda etapa por uma centrifugação de gradiente de densidade clássica Histodenz ^12,13 (Fig. 1) .

Um estudo do proteoma de VCL isolados de D. discoideum revelou mais de 560 proteínas da célula hospedeira, incluindo proteínas associadas com vesículas fagocíticas, mitocôndrias, ER e de Golgi, bem como vários GTPases, que não têm sido implicados na formação LCV antes de ^13. LCVs enriquecido e purificado com oprotocolo descrito aqui pode ser ainda analisada por microscopia (imunofluorescência, microscopia electrónica), métodos bioquímicos (Western blot) e abordagens proteómicos ou lipidomic.

Protocolo

1. Preparativos para isolamento LCV

1. Streak a Legionella pneumophila produzir DsRed-Express ^13,14 a partir de ações de glicerol em placas de ágar CYE com 5 mg / ml de cloranfenicol (Cam) quatro dias antes do isolamento LCV. Incubar as bactérias a 37 ° C.
2. Semente out 1 x 10 ⁷ D. discoideum produzindo GFP-calnexin ou RAW264.7 macrófagos murinos em cultura de tecidos 75 cm ² balões uma infecção dias antes. Use 10 ml HL5 médio com 20 mcg / mL para D. G418 discoideum e incubar a amebas a 23 ° C. Para RAW264.7 macrófagos usar 10 ml de meio RPMI 1640 suplementado com FCS 10% (inactivado....

Discussão

Em contraste com os métodos publicados anteriormente, este protocolo é baseada em dois passos, primeiro a separação dos LCVs por uma abordagem imuno-magnética, e em segundo lugar, a purificação de LCVs por centrifugação em gradiente de densidade. O isolamento LCV pode ser facilmente seguido por microscopia de fluorescência, quando tanto as bactérias fluorescente etiquetado e GFP-produtoras de células ou de coloração de anticorpo é usado. O protocolo aqui descrito é um método simples, hetero-a frente, o que resulta no en.......