Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Resumo

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso de In vitro Métodos para estudar a migração, a auto-renovação, e multipotency da crista neural.

Resumo

O embrionário da crista neural (NC) é uma população de células progenitoras multipotentes que origina na face dorsal do tubo neural, sofre uma transição epitelial para mesenquimal (TEM) e migra ao longo do embrião, dando origem a diversos tipos celulares ^1-3. NC também tem a capacidade única de influenciar a diferenciação e maturação de órgãos-alvo ^4-6. Quando explantado in vitro, células progenitoras de NC submetidos a auto-renovação, migrar e diferenciam-se em uma variedade de tipos de tecidos incluindo neurónios, células gliais, células musculares lisas, cartilagem e do osso.

Multipotency de NC foi descrita pela primeira vez a partir de explantes do tubo neural aviária ^7-9. Em isolamento in vitro de células de NC facilita o estudo de NC dinâmica, incluindo a proliferação, migração e multipotency. Trabalho adicional nos sistemas de aves e de rato demonstraram que as células explantadas NC NC reter o seu potencial quando transplantadas de volta para o embrião ¹⁰-13. Como essas propriedades inerentes celulares são preservadas em progenitores explantadas NF, o ensaio de explante tubo neural fornece uma opção atrativa para o estudo da NC in vitro.

Para alcançar uma melhor compreensão da NC mamíferos, muitos métodos têm sido utilizados para isolar populações NC. NC-derivados progenitores podem ser cultivadas a partir de pós-migratórias locais em ambos o embrião e adulto para estudar a dinâmica dos progenitores pós-migratórias NC ^11,14-20, no entanto isolamento de células progenitoras de NC como eles emigram a partir do tubo neural fornece preservação óptima de NC célula potencial e propriedades migratórias ^13,21,22. Alguns protocolos empregar separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar uma população enriquecida para NC progenitores particulares ^11,13,14,17. No entanto, quando se inicia com embriões na fase inicial, os números de células adequadas para as análises são difíceis de obter com FACS, complicando o isolamento de início NC populations a partir de embriões individuais. Aqui, descrevemos uma abordagem que não depende de FACS e resultados em uma população de aproximadamente 96% NC puro com base em uma Wnt1-Cre repórter linhagem ativado ^23.

O método aqui apresentado é uma adaptação de protocolos otimizados para a cultura do rato NC ^11,13. As vantagens deste protocolo, em relação aos métodos anteriores são de que 1) as células não são cultivadas em uma camada alimentadora, 2) FACS não é necessário para obter uma população relativamente puro NC, 3) células premigratory NF são isolados e 4) os resultados são facilmente quantificado. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de NC a partir de qualquer modelo de rato mutante, facilitando o estudo das características NF com diferentes manipulações genéticas. A limitação desta abordagem é que o NF é removido a partir do contexto do embrião, o que é conhecido para influenciar a sobrevivência, a migração ea diferenciação do NC ^2,24-28.

Protocolo

1. Placas de Preparação

1. Use técnica estéril em todos os momentos.
2. Preparar fibronectina (FN) por diluição de 100 ul de estoque humano FN plasma para um volume final de 3,3 mL em PBS de Dulbecco (DPBS). Concentração final é de 30 ug / mL e esta pode ser armazenada a 4 ° C durante 1 semana.
3. Cobrir parte inferior de cada poço de uma cultura de tecidos estéril quatro placa bem com uma solução de FN e deixar assentar durante 15 minutos. Certifique-se de toda a superfície é coberta. Tornar a mídia durante este tempo (passos 2 e 3).
4. Remover FN solução e permitir que as placas para secar. Suavemente lavar os poços com 500 uL de DMEM, ....

Discussão

Atenção especial deve ser dada à fase de desenvolvimento do embrião para garantir o sucesso desta abordagem. Contando somitos de embriões de rato é fundamental tanto para a fase correspondente embriões dentro de uma maca e determinar as regiões corretas do tubo neural para o isolamento. Uma variação de um ou dois sómitos entre os embriões está dentro de uma gama razoável de tempo de desenvolvimento, dependendo da resolução da experiência realizada. Um embrião entre 9 e 9,5 dpc terá entre 17 e 25 somitos. Se o embrião te.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM (glicose baixa)	Gibco / Invitrogen	11885
Médio Neurobasal	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
DPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Armazenar em 50 ug / ml alíquotas a -20 ° C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Armazenar em 25 ug / mL alíquotas a -20 ° C.
A fibronectina	Gibco	33016-015	Armazenado em 1mg/mL aliquots a -20 ° C.
O ácido retinóico	Sigma	R2625	Armazenar em 35 ug / ml alíquotas após reconstituição em etanol a -20 ° C.
2-mercaptoetanol	Sigma	D-5637
N suplemento 2	Gibco	17502-048
B27 suplemento	Gibco	17504-044
Steriflip de filtros de 0,22 uM	Millipore	SCGP00525
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
0,20 mM filtros	Corning	431219
Seringas (para a filtração)	BD Biosciences	301604
Quatro placas de poços	Thermo Fisher Scientific	176740
Colagenase / dispase	Roche	269 ​​638	Atividade varia por lote. Armazenar em 100 mg / ml alíquotas a -20 ° C.
Agulhas de insulina (29 manômetro ½)	Becton Dickson	309306
Câmara hipóxia	Billups-Rothenberg
Analisador de Oxigênio	Billups-Rothenberg
Fórceps # 5	Belas Ferramentas Ciência		Para a remoção do útero e decídua.
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200