Uma abordagem rápida para investigar as interacções e efeitos sobre os mecanismos moleculares relacionados com a presença de anticorpos em um ambiente intracelular é descrito. O método envolve a transfecção de anticorpos em células vivas utilizam uma formação complexo não-covalente com base em uma formulação de lípidos. A técnica é adaptável a linhas celulares imortalizadas, e células primárias.
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Artigo de método
Transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença
Neste artigo
Resumo
Resumo
Anticorpos fornecem a capacidade de ter uma visão romance em vários eventos que ocorrem em sistemas vivos. A capacidade de produzir anticorpos altamente específicos para proteínas alvo tem permitido muito precisas questões biológicas a ser tratada. É importante notar que os anticorpos têm sido implicados na patogénese de várias doenças humanas, incluindo o lúpus eritematoso sistémico (SLE), artrite reumatóide (RA), as síndromes paraneoplásicas, a esclerose múltipla (MS) e o tipo de vírus T-linfotrópico humano 1 (HTLV-1) mielopatia associada ao / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP) 1-9. Como anticorpos causam a doença é uma área de investigação em curso, e os dados sugerem que as interacções entre vários anticorpos e moléculas intracelulares resultados na inflamação, alterados celular, mensagens e apoptose 10. Tem sido demonstrado que os pacientes com EM e HAM / TSP produzir anticorpos para a proteína de ligação intracelular de proteínas RNA heterogéneo ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dados recentes indicam que os anticorpos para tanto intra-neuronal e antigénios de superfície são patogénicas 3, 5-9, 11. Assim, um procedimento que permite o estudo de anticorpo intracelular: interações proteína daria grande insight sobre a patogênese da doença.
Os genes são comumente transfectado em células primárias e linhas de células em cultura, no entanto a transfecção de anticorpos em células tem sido dificultada pela alteração da estrutura do anticorpo ou a eficiência de transfecção fraca 12. Outros métodos de transfecção incluem a transfecção com base em anticorpo lipossomas catiónicos (consistindo de DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), ambas das quais resultou numa diminuição de 10 vezes na transfecção de anticorpos em comparação com os controlos 12. O método realizado em nosso estudo é semelhante à de lípidos catiónicos mediadas métodos e utiliza um mecanismo de base de lípidos de modo a formar complexos não covalentes com os anticorpos através electrostática e hidrinteracções ophobic 13. Utilizamos Ab-deliverin reagente, que é uma formulação de lípidos capaz de capturar os anticorpos não covalentes através de interacções electrostáticas e hidrofóbicas e entregando-os no interior das células. Assim químico e genético acoplamentos não são necessários para a entrega de anticorpos funcionais em células vivas. Este método permitiu-nos realizar várias anticorpo rastreamento e localização de proteínas experiências, bem como as análises das conseqüências moleculares de anticorpo intracelular: interações proteína 9.
Neste protocolo, será mostrado como os anticorpos para transfectar-se em neurónios rápida, reprodutível e com um grau elevado de eficiência de transfecção. Como exemplo, iremos utilizar anticorpos anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Para a quantificação da eficácia de transfecção fácil o uso do anti-hnRNP anticorpos marcados com A1 Atto-550-NHS e marcado com FITC de IgG. Atto550 SNS é um novo rótulo com absorção molecular alta e yi quânticaeld. Fonte de excitação e filtros fluorescentes para Atto550 são semelhantes a Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Além disso, tem Atto550 fotoestabilidade elevada. Marcado com FITC de IgG foram utilizados como controlo para mostrar que este método é versátil e não dependente tingir. Esta abordagem e os dados que são gerados irão auxiliar na compreensão do papel que os anticorpos para antigénios alvo intracelulares podem desempenhar na patogénese de doenças humanas.
Protocolo
1. Etiquetagem de anticorpos (Figura 1)
- Fazer NaHCO3 0,1 M de tampão:
- 8,4 g de NaHCO3
- 29,2 g de NaCl
- 1 litro de H 2 O
- Traga o tampão até um pH de 8,4 com esta solução (10,6 g de Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litro de H 2 0).
- Adicionar 35 ul de Atto550 NHS a 70 ul de anti-ul NaHCO hnRNPA1 e 500 3-tampão e girar durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a rotação de uma hora, injectar a mistura num dialisador e dializar em 2 litros de PBS durante a noite.
- No dia seguinte, concentrar os dialisados Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizando uma coluna de centrifugação (Amicon Ultra 0,5).
- Após os Atto550 NHS rotulado anti-hnRNPA1 anticorpo foi concentrada, suspensa nano-amostra para determinar a concentração.
2. Transfecção de anticorpos (Figura 2)
- Semente 10 5 células / poço em 500 ul de DulbeccModificado o de Eagle Médium (DMEM/F12 +10% FBS 1% de antibiótico) num poço de deslizamento 8 24 horas antes da transfecção. Confluência de células deve ser, pelo menos, 70%.
- Vinte e quatro horas após a sementeira, adicionar 2 ul de Ab-deliverin reagente para um tubo Eppendorf.
- Em seguida, adicionar 2 ug de Atto550 NHS marcados anti-hnRNPA1 anticorpo (0,5 ug / uL) ao tubo de Eppendorf e mesmo incubar 10-15 min à temperatura ambiente.
- Durante a incubação, aspirar meio e adicionar 394 uL de meio fresco de DMEM para as células.
Nota: Adicionar 500 ul de DMEM para uma câmara de células intactas para actuar como um controlo.
- Após a incubação, adicionar 100 ul de DMEM com a mistura de anticorpos, misture pipetando para cima e para baixo, e adicionar as células em DMEM para um volume total de 500 ul.
- Troque a mídia depois de 48 horas de entrega de anticorpos.
Nota: O protocolo foi repetido com FITC Rigg como controlo positivo.
3. Imagens ao vivo e fixo para determinar a eficiência
- Células de imagem ao vivo às 48 horas usando os Cy3 filtro em um microscópio de fluorescência para a imagem dos transfectadas Atto550 NHS anticorpos marcados.
- Depois de imagem ao vivo foi concluída, aspirar a mídia e as células de correção.
- Depois de meios de aspiração, o tratamento de células com 0,4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente. Lave as células de 4 x 5 min cada com PBS. Em seguida, montar células com meios de montagem contendo DAPI reagente e lamela correção. Medir a eficiência de transfecção das células fixas com Axiovision software. Se Axiovision software não está na mão, basta contar os acontecimentos de sua imagem por resultados mão e ligue para cálculo em 3,7. Em alternativa, o software ImageJ podem ser usados para estes cálculos.
- Primeiro, use o "Eventos" medida para contar o número total de células em sua imagem de escolha com ampliação de 20x.
- Em seguida, use o "Eventos" medida para contar as células que não eramtransfectadas com sucesso anticorpos na imagem mesma ampliação de 20x.
- Para acessar os medidos "Eventos" em um formato estilo Excel, clique em "Propriedades", clique na "Medição" guia, e clique para ver "Como a Tabela".
- Finalmente, use o seguinte cálculo para determinar a sua eficiência de transfecção, comparando os dois eventos previamente medidos: ((células Total - células não transfectadas) / total de células) x 100 = eficiência de transfecção.
4. Resultados representativos
As imagens ao vivo de não transfectada (Figura 3A) em comparação com transfectadas (Figura 3B) neurónios revelam que a rotulagem dos anticorpos (vermelho ou verde, em cada figura) é claramente observado no interior das células (Figura 3B, C, D). Seguindo aspiração e lavagem com meios para remover os anticorpos entre ou aderentes à superfície das células, os anticorpos marcados são ainda presente dentro neurónios (Figura 3C e D). Para o cálculo da eficiência de transfecção, utilizar o software para calcular Axiovision células totais comparados a células que não foram transfectadas com sucesso. Estes valores foram inseridos em uma fórmula de eficiência de transfecção para adquirir a eficiência de transfecção em percentagem do número total de células (Figura 4).
Figura 1. Fluxograma dos procedimentos utilizados para os anticorpos de etiquetas com o 550 Atto NHS de éster seguida de etapas necessárias para concentrar os anticorpos marcados. para ver figura maior .
Figura 2. Diagrama de fluxo dos procedimentos utilizados para transfectar anticorpos marcados em células vivas em cultura.arge.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 3. Vivo imagens dos neurônios transfectadas 48 horas de transfecção seguinte.
Figura 4. Corrigido e enxaguado imagens com acontecimentos contados a fim de determinar a eficiência de transfecção.
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Discussão
A fim de testar hipóteses sobre moléculas específicas e sua expressão, genes e outros vectores normalmente são transfectados em células. O único aspecto deste processo é a capacidade de facilmente anticorpos para transfectar as células alvo. Realizamos este método em cinco experimentos em separado cada um em duplicatas. Resultados de eficiência de transfecção foram semelhantes entre todos os experimentos. É importante notar que o método permite a introdução de anticorpos para dentro da célula, sem alterar a estrutura ou...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Investigação e Desenvolvimento, Pesquisa Médica de Serviço, Departamento de Assuntos de Veteranos. Este estudo foi financiado por uma Prêmio Mérito VA Review (a MCL) e da Universidade do Tennessee, Centro de Ciências da Saúde Fundo de Investigação de Esclerose Múltipla.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | |
| Microscópio fluorescente AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision versão 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC anti-Rigg | OZ Biociências | AI20100 | |
| Atto550 NHS éster | Sigma | 92835 | |
| Ab-deliverin | OZ Biociências | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS antibióticos 1% | Gibco | 11320-033 | |
| Poli-D-lisina-8 assim Slides Cultura | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Modelo 151 | |
| DAPI montar mídia | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialisador | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldeído (solução a 4%) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Referências
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Reimpressões e permissões
