Um Modelo de Rato Baixa Mortalidade para Avaliar vasoespasmo cerebral adiada após hemorragia subaracnóide Experimental

Resumo

Hemorragia subaracnóide aneurismática (HAS) é o sangramento que ocorre no espaço subaracnóide, quando uma ruptura de aneurisma. Enquanto a morbidade e mortalidade por este evento foi em um declínio devido a abordagens de tratamento melhores, o risco de vasoespasmo após hemorragia subaracnóide continua a ser o mesmo que era há alguns anos. A importância de estabelecer um modelo animal abrangente e reprodutível para identificar eventos de iniciação de vasoespasmo cerebral tem sido o foco de pesquisa desde o primeiro uso de ratos em um modelo experimental vasoespasmo em 1979 por Barry Et al. Os trabalhos iniciais em ratos demonstraram que uma única injecção de sangue autólogo para a cisterna magna levou a aguda (dentro de minutos), mas não vasoespasmo cerebral atrasado ^{3, 6, 14}. Aqui nós caracterizar uma baixa mortalidade ratos HAS que resulta em atraso vasoespasmo reprodutível.

Resumo

Objectivo: Para caracterizar e estabelecer um modelo reprodutível que demonstra atrasado vasoespasmo cerebral após hemorragia subaracnóide aneurismática (SAH) em ratos, de modo a identificar os eventos que iniciam, alterações fisiopatológicas e potenciais alvos para o tratamento.

Métodos: Vinte e oito ratos machos Sprague-Dawley (250-300 g) foram arbitrariamente atribuídos a um de dois grupos - HSA ou solução salina de controlo. Hemorragia subaracnóide rato no grupo HAS (n = 15) foi induzido por injecção dupla de sangue autólogo, 48 hr à parte, para a cisterna magna. Da mesma forma, uma solução salina normal (n = 13) foi injectado na cisterna magna do grupo de controlo de solução salina. Os ratos foram sacrificados no quinto dia após a injecção de segundo sangue e os cérebros foram conservadas para análise histológica. O grau de vasoespasmo foi medida utilizando-se secções da artéria basilar, medindo-se a área da secção transversal interna do lúmen utilizando NIH software Image J-. O significado eratestado utilizando Tukey / Kramer análise estatística.

Resultados: Após a análise de secções histológicas, artéria basilar área seccional transversal luminal foram menores no SAH do que no grupo de solução salina, de acordo com o vasoespasmo cerebral no primeiro grupo. No grupo HAS, basilar área da artéria interna (0,056 ± 3 uM) foram significativamente menores do vasoespasmo cinco dias após a injecção de sangue segundo (sete dias após a injecção inicial de sangue), em comparação com o grupo de controlo de solução salina com área interna (0,069 ± 3, p = 0,004). Não houve mortalidade de vasoespasmo cerebral.

Conclusão: O modelo do rato induz uma dupla HAS leve, sobrevivência, vasoespasmo da artéria basilar, que pode ser usado para estudar os mecanismos patofisiológicos de vasoespasmo cerebral num modelo de animal de pequeno porte. A baixa taxa de mortalidade e aceitável é um critério importante de ser satisfeita para um modelo ideal de animais SAH de modo que os mecanismos de vasoespasmo pode ser Elucidated ^{7, 8.} Outras modificações do modelo pode ser feita para ajustar a gravidade aumentada de vasoespasmo e as alterações neurológicas.

Protocolo

1. Cirurgia de rato para Assunto HAS injetado com 0,15 ml de sangue autólogo Arterial

1. O rato é anestesiado utilizando 0,1 mg / kg de Cetamina / Xilazina cocktail roedor e deixada em repouso durante 5 min.
2. Anestesia adequada é confirmado pela redução no reflexo membro posterior.
3. Usando um barbeador eletrônico um pescoço com nariz área de cabelo em torno da sub-região occipital é raspada.
4. O animal é colocado em decúbito dorsal sobre a mesa de cirurgia e a cauda é esfregada com betadine para assegurar uma incisão estéril.
5. A reta uma incisão na linha centímetros é tomada na face ventral da cauda
6. A dissecção é prorrogado até a artéria cauda é identificada e isolada.
7. Através de um cateter de calibre 26 estéril, a artéria da cauda é canulada e 0,15 ml de sangue arterial é retirada para uma seringa.
8. A gaze estéril é enrolado em torno da incisão para garantir a hemostase antes da aplicação do vetbond para selar a incisão.
9. Tele virou rato é de bruços em cima da mesa e da área raspada sobre a região sub-occipital é limpo com betadine.
10. Usando uma incisão vertical na linha média de acesso é obtido para a cisterna magna.
11. Uma vez identificada uma agulha de calibre 25 é inserida dentro da cisterna magna e 0,15 ml de CSF é retirada para uma seringa para evitar o aumento da pressão intracraniana com injecção de volume de sangue autólogo.
12. Agora, a 0,15 ml de sangue extraído a partir da artéria da cauda é injectada lentamente para a cisterna magna.
13. A agulha é deixado no local durante 30 segundos para assegurar a coagulação no espaço subaracnóide e então cuidadosamente retirada.
14. Hemostasia é assegurada e a incisão é fechada através de um dispositivo de grampeamento.
15. O animal é agora colocado inclinado sobre uma superfície de aquecimento, com uma cabeça de 20 ° para baixo a posição durante 20 minutos para permitir que o sangue coagular nas cisternas ao redor da artéria basilar.
16. 1,1-1,15 passos são repetidos durante a segunda hora de cirurgia 48 separados.

2. Cirurgia de rato para Assunto HAS injetado com 0,15 ml de soro

1. O rato é anestesiado utilizando 0,1 mg / kg de Cetamina / Xilazina cocktail roedor e deixada em repouso durante 5 min.
2. Anestesia adequada é confirmado pela redução no reflexo membro posterior.
3. Usando um barbeador eletrônico um pescoço com nariz área de cabelo em torno da sub-região occipital é raspada.
4. O animal é colocado em decúbito dorsal sobre a mesa de cirurgia e a cauda é esfregada com betadine para assegurar uma incisão estéril.
5. A reta uma incisão na linha centímetros é tomada na face ventral da cauda
6. A dissecção é prorrogado até a artéria cauda é identificada e isolada.
7. Através de um cateter de calibre 26 estéril, a artéria da cauda é canulada e 0,15 ml de sangue arterial é retirada para uma seringa.
8. A gaze estéril é enrolado em torno da incisão para garantir a hemostase antes da aplicação do vetbond para selar a incisão.
9. O rat é ligado bruços em cima da mesa e da área raspada sobre a região sub-occipital é pintado com betadine.
10. Usando uma incisão vertical na linha média de acesso é obtido para a cisterna magna.
11. Uma vez identificada uma agulha de calibre 25 é inserida dentro da cisterna magna e 0,15 ml de CSF é retirada para uma seringa e a amostra é armazenada.
12. Agora, a 0,15 ml de solução salina normal (37 ° C) é injectado lentamente na cisterna magna.
13. A agulha é deixado no local durante 30 segundos e cuidadosamente retirado.
14. Hemostasia é assegurada e a incisão é fechada através de um dispositivo de grampeamento.
15. O animal é agora colocado inclinado sobre uma superfície de aquecimento, com uma cabeça de 20 ° para baixo a posição durante 20 minutos.
16. 2,1-2,15 passos são repetidos durante a segunda hora de cirurgia 48 separados.

3. Sacrifício rato

1. No dia 5 após a segunda cirurgia, os ratos são sacrificados por perfusão cardíaca.
2. O rato é dada uma dose fatal (00,2 ml / kg) do Plus Fatal (Vortech PHARMACEUTICALS LTD., Dearborn, MI)
3. Com uma incisão na linha média vertical, a cavidade abdominal é aproximado e do peritoneu é aberto.
4. Uma toracotomia anterior é realizada e o coração é exposto.
5. Através de um cateter de calibre 26 ligada a uma solução de tampão fosfato (PBS pH 7,4 e a 37 °), o animal é drenado de sangue e em seguida é submetido a perfusão com paraformaldeído a 4%.
6. Depois de se assegurar de perfusão adequada, a perfusão é interrompida e o rato é colocado sobre a mesa de decapitação.
7. Após decapitação, um rongeur óssea é utilizada para remover o crânio para a remoção do cérebro.
8. O cérebro e do tronco cerebral são cuidadosamente extraídas da calota craniana e colocados numa solução de paraformaldeído a 4% e armazenados a 4 ° C durante 48 horas.

4. Criando seções para avaliar Vasoespasmo

1. O cérebro de rato que foi agora submerso em sacarose a 30%, durante 4 dias é trazido a thcriostato e para corte.
2. Uma vez cryoprotected, 12 seções pM são criados usando o criostato, com a artéria cerebelar ântero-inferior (AICA) como o ponto de partida para garantir a inter-sujeitos consistência.
3. 20 seções são criados para cada animal, terminando na artéria cerebelar superior (SCA).
4. As secções são colocadas sobre uma lâmina de vidro e avaliou por vasoespasmo utilizando metodologia histológica

Resultados

Dentro dos protocolos descritos acima, há vários passos que acreditamos que requerem uma melhor caracterização do modelo do que o que foi anteriormente descrito na literatura. Aqui vamos focalizar os passos que são essenciais para atingir um reprodutível baixa mortalidade cerebral vasoespasmo modelo animal pequeno e evitar as armadilhas potenciais associados com este modelo se não for feito corretamente.

1. Coleta de sangue autólogo da artéria da cauda:

Colocação cu...

Discussão

Primatas, que tem uma composição mais semelhante genética e características anatómicas para o ser humano, imitar mais de perto os acontecimentos de vasoespasmo cerebral retardado e pode mais facilmente ser submetido a não-invasivo (RNM e angiografia) para monitorar as alterações arteriais, do que os roedores ^8. No entanto, os modelos de primatas são um custo proibitivo e associada aos cuidados mais complexos e questões éticas, que os modelos animais de pequeno porte. Modelos animais pequenos SAH que têm sido ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do equipamento / reagente	Companhia	Número de Catálogo
Ratos machos SD (250-300 g)	Taconic	SD-M
26 Cateteres G	Webster	8416683
25 agulhas G	Búfalo	305122
Seringas de 1 cc	Lojas centrais	54245
Cetamina / Xilazina cocktail	Animal Care (SUNY) *	-
Betadine	Lojas centrais	51458
Sacarose	Sigma	S9378-1kg
Paraformaldeído	Sigma	P6148-500G
Tampão fosfato	Pescador	BP-399-4
Mesa cirúrgica	Harvard	PY2 72-2590
Outubro Composto (crioprotecção)	VWR	25608-930
Slides SuperFrost	Pescador	12-550-15

* Sintetizado no Departamento de Laboratório Animal Care, SUNY Upstate Medical University. Adicionar 1 cc [100 mg / ml] de xilazina a 10 ml [100 mg / ml] de cetamina.