On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Resumo

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

Resumo

A aterogênese é potencializado por anormalidades metabólicas que contribuem para um elevado estado de inflamação sistêmica, resultando em disfunção endotelial. No entanto, as primeiras alterações funcionais no endotélio que significam um nível individual de risco não estão diretamente avaliada clinicamente para ajudar a estratégia de guia terapêutico. Além disso, a regulação da inflamação por hemodinâmica local contribui para a distribuição não aleatória espacial da aterosclerose, mas os mecanismos são difíceis de delinear in vivo. Descrevemos uma abordagem lab-on-a-chip baseado quantitativamente perturbação metabólica ensaio de eventos inflamatórios em células endoteliais humanas (CE) e monócitos em condições de fluxo precisos. Métodos padrão de litografia suave são usados ​​para microfabricate vasculares miméticos câmaras microfluídicos (VMMC), que são ligados directamente para monocamadas de cultura da CE. ¹ Esses dispositivos têm a vantagem de utilizar pequenos volumes de reagentes enquantoproporcionando uma plataforma para imagiologia directamente os eventos inflamatórios na membrana de CE expostos a um campo de cisalhamento bem definida. Temos aplicado com sucesso estes dispositivos para investigar-citocina, ^{2 lípido-3, 4} e RAGE inflamação induzida por ⁵ em aorta humana CE (AHCE). Aqui temos documentar a utilização do VMMC para a célula monocítica ensaio (THP-1) de rolamento e parada em monocamadas HAEC que são condicionadas sob características diferenciais de cisalhamento e activado pela citoquina inflamatória TNF-α. Estudos como estes estão fornecendo uma visão mecanicista em atherosusceptibility sob fatores de risco metabólicos.

Protocolo

1. Cultura de Células e Preparação do Substrato

1. Cortar 3 polegadas substratos circulares de um prato 100 20 milímetros x cultura de tecido (BD Falcon), utilizando um torno. Esterilizar substratos por submersão em etanol a 70%. Colocar em uma placa de Petri e revestimento com 4 ml de colagénio tipo I (100 ug / ml) durante 1 h à temperatura ambiente, em seguida lavar com 4 ml de 1 x PBS.
2. Suspender Humanos células endoteliais aórticas (AHCE, a passagem 4-6) em ⁵ 6.5x10 células / ml e de sementes aplicando 1 ml directamente ao substrato. Colocar em um 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora e permitir que as células aderem ao substrato durante 1 hora.
3. Adicionar 9 ml de crescimento endotelial Médio-2 (EGM-2) suplementado com 1x solução de antibiótico-antimicótico para as células. Alterar meios cada 2 dias até as células atingirem 90% de confluência.
4. Manter células THP-1 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e solução 1x antibiótico-antimicótico. Células de passagem quando atingem uma densidade de 10 ⁶ células / ml.

2. Protocolo Shearing celular

As células são condicionados numa personalizado dispositivo de corte de cone e prato-Cell (CSD). Detalhes do dispositivo e as especificações de concepção estão documentados na Tabela 1 e Figura 4.

1. Prepare o CSD. Esterilizar a caixa de uma câmara com etanol e lavar com PBS estéril. Aquecer a carcaça para 37 ° C e nível para garantir que o cone é perpendicular à monocamada de células. Montar o substrato com as células a partir do fundo da caixa e definir o cone para a altura desejada.
2. Use Leibovitz-15 (L-15) meio suplementado com BulletKit endotelial como o meio de corte para manter o pH apropriado na ausência de CO _2. Para estimular a inflamação, adicionar necrose tumoral-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) ao meio de corte e injectar 6 ml no dispositivo através de uma seringa ligada a um orifício de entrada, tendo o cuidado de não introduzir arbolhas no interior da câmara.
3. Células de cisalhamento com uma elevada tensão de corte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm ²⁾ ou uma tensão de cisalhamento oscilatório (OSS, 0 ± 5 dines / cm ^2, 1 Hz) durante 4 horas. A SS desejado é conseguido pela rotação do cone acima das células, o que é precisamente controlado com um motor de micro-stepping como descrito anteriormente ⁶ A SS parede na superfície (τ _w) é aproximada por.:
   
   onde μ é a viscosidade do meio, ω é a velocidade angular do cone, e α é o ângulo de cone (0,5 °). O alinhamento de cone com o substrato é ajustada para dentro 0,05 ° por meio de nivelamento de precisão e da altura lacuna fixado em 20 ± 10 mM usando um medidor de profundidade para minimizar a variação circunferencial e radial em τ _w. O dispositivo foi validado para garantir características de fluxo laminar. Remova cells a partir do dispositivo e preparar para a análise de adesão de monócitos.

3. Fabricação de PDMS microfluídicos Câmara

1. Obter molde mestre para o número do canal desejado microfluídicos e altura do canal, dependendo da aplicação. As características da concepção específica utilizada neste protocolo são detalhados na Tabela 1. O método para criar estes já está bem documentado na literatura. ¹ Resumidamente, a rede de canais é concebido usando software de CAD (Autodesk Inventor) e impresso em 5000 dpi em uma transparência. Fotorresiste negativo (SU8) é fiado em uma pastilha de silício até uma espessura de 100 mm. A transparência é sobreposto e expostas à luz UV. Non-polimerizado material fotosensitivo é removida para gerar a réplica de mestre positivo.
2. Para fazer a solução de PDMS base de silicone mistura com silicone agente de cura 10:01, em peso, de um barco pesar e agita-se com uma pipeta de 5 ml serológico. Tenha cuidado para não raspar as paredespesar do barco para evitar a adição de flocos de plástico para a solução.
3. Coloque a bolacha mestre em uma placa de Petri 100x15mm e despeje a solução de PDMS para o prato.
4. Cobrir o prato e colocá-lo dentro de um recipiente a vácuo durante 15 minutos para remover bolhas. Depois de 15 minutos tomar a placa de Petri para fora e remover as bolhas excesso suavemente soprando ar sobre a superfície.
5. Colocar a placa de Petri num forno durante 1 hora a 70 ° C. Retire o prato e cortar as câmaras microfluídicos utilizando uma lâmina afiada.

4. Montagem do dispositivo em Microscópio

1. Ligue fonte de luz para microscópio invertido e definir aquecedor para 37 ° C. Anexar tubagem para uma seringa de 10 ml e encher com água destilada de modo que não existem bolhas. Coloque a seringa na bomba de seringa ea taxa de fluxo conjunto para induzir uma parede de SS 1 dine / cm ^2. A tensão de cisalhamento de parede (τ _w) gerado ao longo da linha central do canal é aproximada utilizando o padrãoequação para uma câmara de fluxo de placas paralelas:
   
   onde μ é a viscosidade do meio, Q é o caudal volumétrico, h é a altura do canal, e w é a largura do canal. Nota: uma vez que os canais são de largura finita a real τ _w irá variar com w dependendo do canal relação de aspecto, e as medições são evitados a 25% mais próximo das paredes laterais. ^1,7
2. Coloque PDMS câmara em água e usar uma micropipeta 100 uL para remover o ar a partir dos canais individuais. Ligue o adaptador de câmara de vácuo para garantir que a válvula está definido para fora.
3. Coloque placa de Petri com AHCE monocamada sobre o objetivo. Coloque a câmara de PDMS sobre a placa de Petri e cuidadosamente ajustado na monocamada AHCE enquanto assegurando que não existem bolhas de ar formam entre o dispositivo ea monocamada. Gire a válvula para que o vácuo é ligado ea câmara está bem encaixada.
Cortar 19 agulhas de calibre sem corte tal que existe apenas 5 mm de lado esquerdo do metal. Encha o reservatório de plástico com tampão e colocar em PDMS entrada da câmara. Repetir para número apropriado de canais a serem utilizados. Anexar tubulação de bombas de seringa para saídas de PDMS canal.

5. Ensaio de adesão de monócitos Sob tensão de cisalhamento

1. Suspender células THP-1 em 2x10 ⁶ células / ml em HBSS + Ca ^{2 +} / Mg ^{+ + 2} HSA a 0,1%. Activar células THP-1, por incubação com factor-1 derivado do estroma (SDF-1, 50 ug / ml) durante 15 min à temperatura ambiente.
2. Ligue bomba de seringa para estabelecer o fluxo, em seguida, adicionar 50 ul de suspensão de células para o reservatório sem a introdução de bolhas de ar. Quando o fluxo é totalmente desenvolvido, comece a aquisição de dados.
3. Executar durante 5 min a taxa de fluxo adequado, adicionando tampão para o reservatório se a solução fica baixo. Continue fluindo tampão para os canais para lavar as células não ligadas na corrente de fluxo.

6. Aquisição de Dados e Análise

1. Adquirir sequências de imagens digitais em 3 de imagens / s durante 2 min após o fluxo totalmente desenvolvida ao longo do eixo longitudinal do canal, 3 localizações no canal, tendo cuidado para não gravar imediatamente após a entrada ou antes ou aberturas de saída no 25% mais próximo do lado paredes.
2. Contar o número de células presos por campo, identificando a sua aparência fase brilhante no mesmo plano focal como a monocamada.
3. Prisão célula firme é definida pelo movimento <½ diâmetro da célula em 10 s. Média de dados com mais de 3 campos aleatórios / canal e quantificar usando software ImageJ.

7. Os resultados representativos

Embora o endotélio vascular é uniformemente expostas a agonistas que contribuem para a inflamação sistémica, a aterosclerose é uma doença focal que se desenvolve preferencialmente em locais de perturbação do fluxo nas artérias, implicando heterogeneidade espacial da função endotelial. ⁸ 9, 10 TNF-α induz uma resposta bem caracterizados em CE que inclui up-regulation de moléculas de adesão celular (CAM ; por exemplo, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) e quimiocinas que recrutam monócitos da circulação, uma característica da lesão aterosclerótica precoce ¹¹ Hemodinâmica é um importante regulador do fenótipo inflamatório endotelial ¹² tensão de cisalhamento alta magnitude (HSS..; por exemplo de 15 dines / cm ²⁾ ou tensão de corte pulsátil (PSS; por exemplo, 15 ± 5 dinas / cm ²⁾ associados com sítios de resistência à aterosclerose em artérias down-regulam TNF-α as respostas induzidas. Por outro lado, baixa tensão de cisalhamento magnitude (LSS, por exemplo, 2 dinas / cm ²⁾ ou de cisalhamento oscilatório (OSS; por exemplo, 0 ± 5 dinas / cm ^2), característico de locais suscetíveis in vivo, exacerbar cytokine inflamação induzida ^{13., 14} Nossos dispositivos microfluídicos de PDMS fornecer uma plataforma para a realização de estudos sobre os mecanismos para testar hipóteses relacionadas com a superposição de estresse metabólico com fatores hidrodinâmicos na regulação da função endotelial e patologia. A utilidade e versatilidade da abordagem é amplamente ilustrado através dos resultados representativos que se seguem.

Figura 1. Tensão de cisalhamento diferencialmente modula THP-1 de adesão celular para monocamadas inflamadas de TNF-a endoteliais. Estes dados foram adquiridos utilizando o protocolo detalhado acima descritos e documentados no vídeo. Monocamadas HAEC foram simultaneamente expostos a uma dose baixa da citoquina inflamatória TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE ₅₀ para VCAM-1 up-regulation) e quer HSS (15 dines / cm ²⁾ ou OSS (0 ± 5 dinas / cm ^2, 1 Hz), em um CSD personalizado para 4 hr como descricama no protocolo detalhado. THP-1 de detenção celular foi quantificada sob fluxo de cisalhamento em uma câmara de fluxo PDMS. Esta linha de células que imita o fenótipo de monócitos humanos foi escolhido pela sua reprodutibilidade e facilidade de utilização. HSS atenuou a resposta inflamatória em comparação com OSS, resultando numa redução de detenção célula THP-1. Os dados foram analisados ​​pelo teste t de Student e estão representados como média ± EPM de 3 experimentos independentes. Adaptado com permissão de DeVerse et al. ⁵

Os dados a seguir demonstram a versatilidade da nossa abordagem usando exemplos do nosso trabalho publicado. Saídas a partir do protocolo acima são indicados onde for aplicável.

Figura 2. Modulação da expressão de VCAM-1 induzida por citocina e recrutamento de monócitos em um gradiente de tensão de cisalhamento. A) monocamadas HAEC foram estimuladas com TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h sob flow em uma VMMC desenhado com base Hele-Shaw teoria de fluxo. ¹⁵ Uma diminuição linear em magnitude SS ao longo da linha central do canal foi conseguida através da concepção de as paredes laterais da câmara de modo a coincidir com a simplifica de um fluxo de estagnação bidimensional e moldando o fim do canal para coincidir com as linhas de iso-potenciais. A tensão de cisalhamento de parede (τ _w) gerado ao longo da linha central deste canal a uma distância axial a partir da entrada (x) é dada por:

onde μ é a viscosidade do meio, Q é o caudal volumétrico, h é a altura do canal, w ₁ é a largura do canal de entrada, e L é o comprimento total do canal. Q foi escolhido para gerar um gradiente em magnitude SS a partir de 16 ^dines/cm2 na entrada a 0 no ponto de estagnação "a" apenas proximal ao outlet. B)-C) VCAM-1 expressão foi medida in situ por microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos conjugados com pontos quânticos e apresentados como percentagem de intensidade de fluorescência média (IFM) de não estimulada controlo estático. SS não modular o nível basal da expressão de VCAM-1, que é baixa em AHCE não estimulada (triângulos cinza). No entanto, a VCAM-1 em relação à expressão aumentada de TNF-α em magnitudes de LSS, atingindo um máximo de ~ 2 dines / cm ² e retornando à linha de base de TNF-α ou abaixo em magnitudes de cisalhamento> 5 dinas / cm ² (quadrados pretos). D) Os monócitos (10 ⁶ / ml) foram perfundidos menos 2 dines / cm ² por 5 min, em canais de fluxo paralelos sobre monocamadas pré-condicionadas como em A). Recrutamento de monócitos ao endotélio quantitativamente correlacionada com a expressão VCAM-1 com uma grandeza dada cisalhamento. Notavelmente, a capacidade para sondar VCAM-1 e expressão recrutamento de monócitos com resolução espacial muito bem em um monolayer revelou alterações significativas ao longo de um intervalo estreito em magnitude SS que não seria apreciada através da aplicação de apenas alguns valores discretos de cisalhamento em experiências separadas. Os dados foram analisados ​​por ANOVA repetidas medidas e as diferenças avaliadas por pós-teste de Newman-Keuls, * P <0,05 a partir de TNF-α, em condições estáticas. Os dados são média ± EPM de 3-6 experimentos independentes. Adaptado com permissão de Tsou et al. ²

Figura 3. Triglicéridos ricos em lipoproteínas (TGRL) modulam citocina induzida por inflamação em proporção aos níveis séricos de doadores de triglicéridos e VCAM-1 de expressão. Monocamadas HAEC foram estimuladas com TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 horas em simultâneo com TGRL (10 mg / dl ApoB) isolado a partir de sujeitos humanos após uma refeição com elevado de gordura em cultura estática. A) VCAM-1 expressão foi medida separadamente em CE suspenso por citometria de fluxoe adesão de monócitos quantificados utilizando um VMMC como descrito no protocolo detalhado. Os dados são apresentados como% de mudança de TNF-α. Prisão de monócitos variaram em proporção directa com endotelial VCAM-1 expressão, o que aumentou directamente com o nível de triglicéridos no soro dador. B) detenção de monócitos para um subconjunto de pró-inflamatórias dadores foi abolida na presença de um VCAM-1 anticorpo bloqueador. A significância foi determinada pelo emparelhado teste t de Student, médias ± SEM de 3-5 experimentos independentes. Adaptado com permissão de Wang et al. ⁴

Discussão

Descrevemos a utilização de dispositivos microfluídicos PDMS para a avaliação no chip do fenótipo inflamatória endotelial através da imagem em tempo real da CAM expressão e adesão de monócitos. Uma grande vantagem da nossa abordagem reside na capacidade para quantificar resultados associados com a disfunção endotelial em células expostas a mediadores inflamatórios, tais como lípidos da dieta e citocinas, sob condições hidrodinâmicas definidos que espelham tensão de cisalhamento em vasos aterogênicas. O VMMC facilitar a ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Item	Companhia	Número de Catálogo
100 x 20mm placas de Petri	BD Falcon	353003
Etanol 95%	Merck Química	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21-031-CV
O colágeno tipo I da cauda de rato Derived	Gibco	A10483-01
Células endoteliais aórticas humanas	Genlantis	PH30405A
Antibiótico-antimicótica Solution	Invitrogen	15240-062
BulletKit endotelial	Lonza	CC-4176
Endoteliais basais Mídia-2	Lonza	CC-3156
Seringas 10 ml	BD Falcon	309604
Tubo de poliuretano	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 Meios	Gibco	11415-069
Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone	A Dow Corning	184
Sylgard 184 Agente de Cura Silicone Elastômero	A Dow Corning	184
SU8 Wafer Mestre Photoresist	UC Davis Pan Lab	N / A
Eclipse TE200 microscópio invertido	Nikon	Eclipse TE200
Bomba de seringa	Harvard Apparatus	PHD2000
19 agulha hipodérmica calibre	Kendall	8881
THP-1 da linha celular monocítica	ATCC	TIB-202
HBSS (solução salina tamponada com Hanks) com Ca 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α)	R & D Systems	210-TA-010
Fator Derivado do Estroma - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV
Albumina de soro humano (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32