Medição de condutividade hidráulica da folha e da condutância estomática e as respostas a irradiância e Desidratação Usando a evaporação Método Flux (EFM)

Resumo

Descreve-se um método relativamente rápido (30 min) e, simultaneamente, realista para medição da condutância hidráulica folha ( K Folha) E condutância estomática ( G S) Para transpirar folhas excisadas. O método pode ser modificado para medir as respostas de luz e de desidratação K Folha E G S.

Resumo

A água é um recurso fundamental, e a planta do sistema de transporte de água estabelece limites para o máximo crescimento e tolerância à seca. Quando as plantas abrir os estômatos para alcançar uma alta condutância estomática (g _s) para capturar o CO ₂ para a fotossíntese, a água é perdida pela transpiração ^1,2. A evaporação a partir dos espaços aéreos é substituída a partir de paredes de células, por sua vez, o desenho de água a partir do xilema de nervuras, por sua vez, no desenho a partir de xilema nos caules e nas raízes. Como a água é puxada através do sistema, ela experimenta uma resistência hidráulica, criando uma tensão ao longo do sistema e um baixo potencial hídrico de folha (Ψ _folha). A folha em si é um gargalo crítico no sistema de planta inteira, o que representa em média 30% da resistência da planta hidráulica ^3. Condutância hidráulica (K = resistência _{de folha} uma folha / hidráulico) é a razão entre a taxa de fluxo de água para o gradiente de potencial hídrico em toda a folha, e resume acomportamento de um sistema complexo:. água se move através do pecíolo e através de várias ordens de veias, sai na bainha e passa através ou em torno de células do mesofilo antes de evaporar no espaço aéreo e sendo transpirou da estômatos das _folhas K é de grande interesse como uma traço fisiológico importante comparar as espécies, a quantificação da eficácia da estrutura da folha e fisiologia para o transporte de água, e uma chave variável para investigar a sua relação com a variação na estrutura (por exemplo, na arquitectura venation da folha) e os seus efeitos sobre as trocas gasosas fotossintéticas. Além disso, K _folha responde fortemente ao ambiente da folha interna e externa ^3. _Folha K pode aumentar dramaticamente com irradiância aparentemente devido a alterações na expressão e activação das aquaporinas, proteínas envolvidas no transporte de água através de membranas de ⁴ e _folha K diminui fortemente durante drdeveria, devido a cavitação e / ou o colapso das condutas do xilema, e / ou perda de permeabilidade dos tecidos do xilema-extra devido ao encolhimento e mesofilo feixe de células da bainha ou desactivação aquaporina ^5-10. Porque K _folha pode restringir g _s e taxa fotossintética em espécies em condições bem regada e durante a seca, e, assim, limitar o desempenho planta inteira que pode, eventualmente, determinar a distribuição das espécies, especialmente as secas aumentam em freqüência e gravidade ^11-14.

Nós apresentamos um método simples para a determinação simultânea de K _foliar e _s g de folhas excisadas. Uma folha transpirante é ligado por sua pecíolo de tubagem em execução para uma fonte de água no equilíbrio. A perda de água a partir do balanço são registados para calcular a taxa de fluxo através da folha. Quando transpiração estado estacionário (E, mmol m ^-2 • • s ^-1) é atingido, g K _{da folha,} dividindo pela força de condução potencial de água determinado utilizando uma câmara de pressão (K _folha = E / - Δψ _folha, MPa) ^15.

Este método pode ser utilizado para avaliar as respostas _{da folha} de K para diferentes irradiâncias e na vulnerabilidade da _folha K à desidratação ^14,16,17.

Protocolo

1. Condutância da folha de medição hidráulica para Folhas hidratado (K _max)

1. Colete tiros de preferência à noite ou a noite de tal forma que as tensões do xilema são baixos, corte no ar e coloque em saco plástico escuro repleto de toalhas de papel molhado. No laboratório, recut pelo menos dois nodos a partir do final de cada tiro sob a água. Deixe disparar hidratar durante a noite em água pura, ou outra solução a ser usado para as medições de _folha K. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator.
2. Corte a folha do tiro com uma lâmina de barbear fresco sob solução fluxo parcialmente desgaseificado. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator. Recomendamos desgaseificação a solução durante a noite num frasco utilizando uma bomba de vácuo, mas outros métodos podem ser utilizados.
3. Envoltório parafilme pré-esticada ao redor da petiole para assegurar uma boa vedação entre o pecíolo e tubos. Este passo é especialmente útil para não-redondas pecíolos, como embrulho parafilme extra vai ajudar em volta do pecíolo para caber dentro da tubulação. Pasta dental pode ser aplicado ao pecíolo antes de envolver o parafilme para preencher sulcos em pecíolos.
4. Ligue a folha de tubo de silicone em água ultrapura para evitar que o ar que entra no sistema. À medida que a folha é levantada acima da fonte de água, a água na tubagem está sob pressão subatmosférica, e, portanto, a vedação é boa se nenhum ar é aspirado para dentro do tubo durante a medição. Como alternativa para vedar o pecíolo directamente na tubagem de silicone, com um encaixe de compressão da junta de borracha podem ser usados ​​(por exemplo, (Omnifit A2227 adaptador furo; Omnifit, Cambridge, Reino Unido); esta abordagem é útil para o pecíolo com formas especialmente complexos, ou por folhas de relva , que pode ser envolvida em torno de uma vareta de vidro e seladas com o encaixe de compressão. Quando possível, selando o pecíolo directamente em silicone tubagem tem a vantagem de ser rápida e deixando uma junção pecíolo-tubo, que é transparente, permitindo que as bolhas sejam mais facilmente vistos. A tubagem liga a folha de tubo rígido correr para um cilindro graduado no equilíbrio (± resolução 10 ug), que regista dados cada 30 segundos a um computador (por exemplo, utilizando "Balance Link" Software; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Suíça) para o cálculo da taxa de fluxo através da folha.
5. As folhas devem ser realizadas para cima superfície adaxial em molduras de madeira amarradas com linha de pesca acima de um ventilador grande caixa e sob uma fonte de luz (> 1.000 m ² mol • • s ^-1 radiação fotossinteticamente ativa de alta irradiância medições), ligeiramente acima do nível de o menisco no cilindro graduado. A folha deve ser colocada acima da água no cilindro graduado para assegurar que a água em movimento para a folha é impulsionado pela transpiração, e que não entram na folha sob pressão devido à gravidade, como o fariaser o caso se a folha foi colocado abaixo do menisco da água no cilindro. Pequenos recipientes cheios com uma toalha de papel molhado é colocado dentro da câmara de equilíbrio para assegurar o ar no equilíbrio é saturado com água, evitando assim a evaporação a partir da fonte de água para a atmosfera na balança. Esta possibilidade pode ser verificada por travar a fluir para a folha, usando uma válvula de torneira de quatro vias na tubagem, e verificar que a massa do cilindro de água sobre o saldo não diminui.
6. Coloque um recipiente de Pyrex transparente cheio de água acima da folha para absorver o calor da lâmpada.
7. Manter a temperatura da folha, entre 23 ° C e 28 ° C durante toda a experiência por adição de água mais fria para o recipiente de Pyrex de tal modo que a lâmpada de aquecimento não aquece o recipiente de Pyrex suficiente para aquecer o ar em torno da folha inferior.
8. Permitir que a folha a transpirar em cima do aparelho, pelo menos, 30 min, dando assim tempo suficiente para aclimatar a alta irradiância e additionally taxa de fluxo até que tenha se estabilizado, sem tendência para cima ou para baixo, e com um coeficiente de variação <5%, pelo menos no local de medição 5-10 feitas a intervalos de 30 seg de fluxo. É essencial para a taxa de fluxo para atingir um estado de equilíbrio, porque este método pressupõe uma _folha Ψ estável. Estudos anteriores encontraram estes critérios para ser suficiente para a estabilização do caudal (E), _{folha folha} Ψ e K; testes com períodos mais longos de medição após fluxo estável foi estabelecido não mostrou qualquer relação de _folha K para o tempo de medição de cada um dos sete espécies de uma gama gama de folha capacitância ^17,18. Estabilização geralmente demora de 30 minutos ou menos, mas, em algumas espécies podem requerer mais do que uma hora para algumas espécies.

Nota: Quando o caudal é muito baixa (<8 ug s ^-1), a estabilidade pode ser determinado usando a média das últimas cinco intervalos de 30 seg.

9. Descarte as medições se o fluxo muda de repente, quer devido ao fechamento dos estômatos súbita, ou fugas resulta do selo ou bloqueio no sistema por partículas ou bolhas de ar.
10. Quando o fluxo se estabiliza, registrar a temperatura da folha com um termopar.
11. Remover rapidamente a folha do tubo, dab secar o pecíolo e colocar a folha para um saco selável, que tinha sido previamente exalado em, para interromper a transpiração.
12. Deixe que a folha se equilibrar no seu saco, pelo menos, 20 min.
13. A média dos últimos 10 medições da vazão. Esta será a sua medição E.
14. Quando a folha é equilibrada, medir o potencial da água na última folha (Ψ _final) com uma câmara de pressão.
15. Medir a área foliar com um digitalizador de mesa e software de processamento de imagem, ou com um medidor de área foliar.
16. K _folha é calculado como E / _ΔΨ-folha (onde ΔΨ _folha = Ψ _finais - 0 MPa) e mais normalizada pela área foliar. As unidades estão em mmol m ^-2 s ^-1 MPa ^-1. Porque a folha está posicionada logo acima do nível da água no cilindro graduado, o efeito da gravidade na redução da pressão de água que entra na folha seria insignificante, especialmente em relação ao _último Ψ, que é sempre> MPa -0,1.
17. Para corrigir as alterações na _folha K induzida por dependência da temperatura da viscosidade da água ^15,19,20, padronizar os valores de K _{da folha} a 25 ° C, utilizando a seguinte equação:

18. Condutância estomática (g _s) pode ser determinada como E dividido pela diferença de pressão entre folha e de vapor do ar, equivalente à pressu vapordéfice re (DPV), determinada utilizando uma temperatura e sensor de humidade relativa adjacente à folha. VPD é calculada usando a seguinte equação ²¹

onde RH é a humidade relativa, VP é a pressão de vapor de saturação do ar (em kPa; uma função da temperatura, de acordo com a equação de Buck Arden ^22), e AP, a pressão atmosférica (em kPa).

2. Medição de condutância da folha hidráulica para folhas desidratadas

1. Colete tiros de preferência à noite ou a noite de tal forma que as tensões do xilema são baixos, corte no ar e coloque em sacos plásticos escuros cheios de toalhas de papel molhado. No laboratório, recut pelo menos dois nodos a partir do final de cada tiro sob a água. Deixe disparar hidratar durante a noite em água pura, ou outra solução a ser utilizado para o K _lemedições AF. Água ultrapura é recomendado como uma solução de fluxo, a menos que os impactos das diferentes soluções estão a ser investigada como um fator.
2. Cortar brotos em segmentos com pelo menos três folhas sob água ultrapura e desidratar tiros com um ventilador por diferentes períodos de tempo para um intervalo de valores _{da folha} Ψ.
3. Uma vez que tiros são desidratadas, coloque sacos sealable (Whirl-Pak; Nasco, Fort Atkinson, WI, EUA), que tenham sido previamente exalado em) em torno de cada folha do tiro, e em seguida, coloque a filmagem inteira em um grande saco lacrado com papel molhado toalha.
4. Deixe a filmagem equilibrar durante pelo menos 30 min (para sessões fortemente desidratados vezes equílibrio mais longos podem ser necessários).
5. Após o equilíbrio, imposto a folha superior e inferior e medida inicial Ψ _folha (Ψ = _o) utilizando uma câmara de pressão.
6. Descartar o tiro, se a diferença na _folha Ψ destas duas folhas é superior a 0,1 MPa (por stronfolhas desidratadas gly, este intervalo pode ser alargado a 0,3 MPa).
7. A terceira folha é então usado para determinar K _foliar e g _s com a EFM, seguindo as etapas de 1,2 -1,18 acima. Notavelmente, E estado estacionário pode ser obtida, mesmo para as folhas que foram severamente folhas desidratadas, como estômatos abrem e gerar valores substancialmente maiores do que a condutância cuticular ¹⁷ g _s.
8. Para a construção das curvas de vulnerabilidade hidráulicos, calcular K _folha utilizando o _último Ψ como no passo 1.16, e, em seguida, os valores de K da trama _folha contra o que for mais baixo, _o Ψ Ψ ou _final, ou seja, a mais forte desidratação experimentado pela folha durante a experiência (= Ψ _menor). Do mesmo modo, a queda de g _s, em resposta a desidratação da folha pode ser determinado através da representação gráfica g _s contra Ψ _menor. Trabalho anterior tem sh desidratação que induz próprio, pelo menos, parcialmente declínios irreversíveis em _folha e K _s g ^14,16.
9. Recomendamos obter pelo menos 6 valores de K _foliares por 0,5 MPa de intervalo _menor Ψ (esse intervalo pode ser reduzida para 0,25 MPa, se a espécie que está a trabalhar é muito vulnerável à desidratação).
10. Realizar teste Dixon outlier em valores _{da folha} de K para cada intervalo de água de 0,5 MPa potencial de _menor Ψ para remover outliers em sua curva de vulnerabilidade ^23.
11. Porque as espécies diferem em suas respostas de K _foliar e _s g à desidratação ^14,16, cabem funções diferentes para cada espécie e selecione a máxima verossimilhança (menor valor do AIC, ver ¹⁴ para detalhes). Recomendamos montagem, pelo menos, quatro funções anteriormente utilizados na literatura: linear (pg "fo: conteúdo largura =" 1.4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg "/>), sigmoidal ( ), Logística ( ) E exponencial ( ).

3. Resultados representativos

O declínio da condutância hidráulica folha com desidratação varia fortemente entre as espécies (Fig. 1). Espécies sensíveis à seca experimentar um forte declínio em potenciais hídricos menos negativos do que as espécies mais tolerantes à seca, quando medido sob alta irradiância (PAR> 1.000 mmol m ^-2 • • s ^-1). A águapotencial de 80% de perda de condutividade hidráulica (P ₈₀₎ para mesic erva Helianthus annuus foi de 3 MPa menos negativa do que a de Heteromeles arbutifolia, nativo da Califórnia chaparral. Heteromeles arbutifolia responderam linearmente para o declínio no potencial de água, enquanto que Helianthus annuus mostrou um não -linear declínio.

Condutância estomática (g _s) e condutância hidráulica folha _(folha K) podem também reagir de forma dramática a irradiância (Fig. 2). Para Raphiolepis indica, a condutância estomática diminuiu fortemente com a desidratação de folhas medidos sob alta irradiância (PAR> 1.000 mmol m ^-2 • • s ^-1) e sob a luz de laboratório (PAR <6 mmol m ^-2 • • s ^-1). Sob alta irradiância, as folhas medido com o EFM que tinha sido desidratado para o potencial de água que é típico para bem iluminado leaves de plantas intactas ao meio-dia mostrou semelhante g _s como para as folhas medidos nas plantas com uma porômetro (estrela na fig. 2). Notavelmente, para as folhas de hidratação máxima, K _foliar foi quatro vezes maior de folhas expostas à alta do que baixa irradiância (11 vs 2,8 mmol m ^-2 s ^-1 MPa ^-1) e, portanto, K _folhas apresentaram resposta mais forte a luz do bem folhas hidratadas do que g _s. Além disso, sob alta irradiância, K _folha diminuiu mais fortemente com a desidratação. A P ₈₀ foi de 0,93 MPa menos negativo em alta de baixa irradiância.

Figura 1. Curvas Folha hidráulicos de vulnerabilidade para uma seca sensível (em cima) e um tolerantes à seca (inferior) a partir de espécies ^(14,24). Cada ponto representa um pecadomedição gle de folha condutância hidráulica (K _folha) sobre uma folha separada usando o método de evaporação do fluxo (EFM). As barras verticais representam o potencial da água no qual as espécies perdeu 80% da condutância inicial hidráulica (P _80). Melhores funções de ajuste utilizando máxima verossimilhança são plotados para ambas as espécies.

Figura 2. A resposta da condutância estomática (g _s) e condutância hidráulica (K _folha) para o potencial de água na folha de declínio Raphiolepis indica medido sob alta vs baixa irradiância (de ^16). (PAR> 1.000 e <6 mmol m ^-2 • • s^-1). Cada ponto representa uma única medição em uma folha separada usando o método de fluxo de evaporação (EFM), com pontos brancos e negros representam folhas medidos sob alta irradiância e baixo, respectivamente. Equações para curvas de condutância estomática em alta irradiância vs baixo: e . Equações para as curvas de vulnerabilidade em alta irradiância vs baixo: e . A estrela de cinza no painel superior representa a média ± standard erro para g _s e potencial de água na folha medida em folhas de plantas intactas ao meio-dia com um porômetro. Cinza e preto barras verticais no painel inferior representa o potencial de água em que a espécie perdeu 80% da condutância foliar inicial hidráulica (P ₈₀₎ sob alta irradiância e baixo, respectivamente.

Discussão

O método de evaporação do fluxo aqui apresentada permite a determinação relativamente rápida (30 minutos) de condutância hidráulica foliar em laboratório com medição simultânea da condutância estomática.

A EFM é medida pelo método que se segue mais de perto a via natural de água das folhas, dado que a água evapora nos espaços aéreos folha e difunde a partir do estomas ^15. Uma série de outros métodos experimentais para determinação K _folha existem ^25, com três sendo especialmente comum. (1) No método de fluxo de alta pressão (HPFM), a água é empurrada através da folha sob pressão elevada, ^15,26. No entanto, as curvas de vulnerabilidade não pode ser obtida com este método porque aplicadas pressões positivas podem encher êmbolos e hidratar o tecido mesófilo. (2) No método de re-hidratação cinética (RKM), K _folha é calculada usando a analogia entre a re-hidratação das folhas desidratadas com o charging de um condensador em série com um ^27,28 resistores. Este método é rápido, mas não se reproduzem todo o sistema de vias naturais transpirational na folha e não é facilmente modificado para permitir a medição de folhas aclimatadas à alta irradiância. (3) No método de bomba de vácuo (VPM), a folha é colocada numa câmara, a sua pecíolo ligado a uma fonte de água no equilíbrio, enquanto aspiradores de intensidades diferentes são aplicadas a uma perda de condução da água da folha da folha de ^15,26. Este método pode ser demorado. As medições utilizando os três métodos foram encontrados para dar resultados consistentes ^15,28,29, e, assim, o EFM é frequentemente utilizado devido à sua baseando-se em movimento de água transpirational, e sua rapidez relativa, e a sua modificação para a medição de _folha K sob diferentes condições.

Todos os métodos típicos usados ​​para a determinação _{da folha} K envolvem um grau de incerteza na quantificação accurately a força motriz que corresponde a transpiração ^25. Na EFM, a _folha utilizada para calcular ΔΨ _folha K é menor do que a verdadeira força motriz, uma vez que se baseia na _folha Ψ granel após a folha é equilibrada pela bomba de pressão. Neste ponto, a _folha Ψ granel que não representam necessariamente o potencial da água das células no final da via hidráulica, em que a água se evapora, mas sim uma média ponderada por volume para as células de um número relativamente pequeno de baixo potencial hídrico onde a água é mover-se e evaporando, e para as células mais numerosas de água elevado potencial que podem ser isoladas a partir do fluxo de transpiração. Quanto a _folha Ψ difere da verdadeira força motriz depende, assim, em que a água se evapora na folha. Se a água evapora toda a folha, a _folha Ψ em massa pode estar perto da verdadeira força motriz, e se a água evapora apenas de c relativamente poucosells perto dos estomas, a _folha de massa pode Ψ substancialmente subestimam a verdadeira força motriz, isto é, o potencial da água das células podem, de facto, ser muito mais baixa e, portanto, _folha K real seria menor do que a verificada com o MFE. Assim, na medida em que K _folha determinada pelo EFM representa a _folha verdadeira K é sensível às vias de fluxo de água, o que ainda não são bem compreendidas. Enquanto o EFM fornece dados que correspondem aos de outros métodos de medição K _folha (ver acima), e é excelente para utilização comparativa, a possibilidade de variação da espécie em vias de fluxo de água através do mesofilo precisa de mais investigação. Com efeito, mesmo para folhas de espécies dadas, estas vias de água podem variar em diferentes condições, por exemplo, sob diferentes irradiâncias e cargas de calor ^4,30 ou do estado da água diferente (dado o encolhimento do tecido) ^31. Mais conhecimentodas vias de transporte de água, o que permitiria a EFM para ser utilizado para resolver os efeitos das mudanças de vias de transporte da folha global hidráulico.

A medição da condutância estomática na EFM tem as vantagens de permitir a determinação de respostas a irradiância e desidratação, e proporcionando as respostas correspondentes de g _s com _folha K. Além disso, o efeito de desidratação da folha anterior, seguido por re-hidratação em g _s pode ser avaliada com o presente método. No entanto, este método tem duas desvantagens potenciais. Em primeiro lugar, esta medição g _s é feita sobre uma folha excisada, em vez de uma planta intacta e, segundo, a determinação da condutância estomática é baseada na medição do clima certa distância da folha, em vez de fechar a folha como em uma câmara porómetro , embora a folha de ventilação com o ventilador equilibra a superfície da folha com o ar circundante. Para algumas espécies, excisadosfolhas podem apresentar diferentes respostas estomáticas do que para as folhas em uma planta intacta ^16,32. No entanto, por várias espécies g _s estimados utilizando a EFM foi semelhante aos valores medidos nas plantas intactas com um porómetro de folhas ao meio-dia Ψ _folha ¹⁶ (Fig. 2).

A EFM podem ser aplicados para discernimento fisiológico, isto é, investigar a dinâmica de K _foliar, a sua base na estrutura e anatomia, e suas respostas aos factores ambientais. Além disso, o método pode ser utilizado para comparar as plantas de espécies dadas crescidas sob diferentes condições, ou de diferentes idades, ou para comparar diferentes espécies de plantas adaptadas a diferentes ambientes.

Através da construção de curvas de vulnerabilidade folha, pode-se obter insights sobre os mecanismos de tolerância à seca espécies. Durante a seca, a cavitação e colapso de células têm sido mostrados para ocorrer no xilema folha de algum espécies e encolhimento da célula no mesofilo durante a desidratação pode também influenciar o movimento da água (revisto em ^14). Estudos futuros serão necessários para determinar a importância relativa de cada um destes processos na condução do declínio de K _foliar e fecho estomática.

Irradiância também é um fator forte influenciando K _foliar eo EFM é altamente adequado para medições sob alta irradiância. A resposta combinada das aquaporinas a irradiância e seca deve ganhar muito interesse. Irradiância elevada conduz a um aumento da expressão e / ou activação de aquaporinas que permitem o fluxo rápido de água através de células vivas, aumentando _folha K, ao passo que leva à desidratação expressão reduzida e / ou de activatation de aquaporinas, reduzindo _folha K. Os impactos combinados de irradiância e de abastecimento de água na _folha K requerem mais investigações ^4,10,16,33.

tenda "> Além disso, através das espécies, K _folha e sua vulnerabilidade tem sido relacionado com a distribuição das espécies em relação ao fornecimento de água, luz e outros recursos ^3,13,24. Espécies de áreas secas tendem a mostrar maior resistência à queda hidráulica, de frente potenciais hídricos mais negativos do solo, e mantendo uma _folha K elevado a potenciais mais negativos de água, que possam manter elevados g _s e continuar a captura _de CO2 para a fotossíntese ^13,14. Assim, o estudo de propriedades hidráulicas folha fornece uma visão ao nível do celular, folha, e toda a planta e suas respostas ao meio ambiente, e é susceptível de produzir inúmeras novas descobertas importantes em todas as escalas.