Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

Resumo

A auto sustentável regulação sistema bacteriano para a remediação de contaminações de óleo foi desenhado usando o padrão partes do DNA intercambiáveis ​​(BioBricks). Uma engenharia E. coli foi usada para degradar a alcanos via β-oxidação em ambientes aquosos tóxicos. As enzimas respectivos de diferentes espécies mostraram atividade de degradação alcano. Além disso, um aumento da tolerância ao N-Hexano foi conseguida através da introdução de genes a partir de alcano-tolerantes bactérias.

Resumo

Este trabalho apresenta um conjunto de ferramentas que permite a conversão de alcanos por Escherichia coli e apresenta uma prova de princípio de sua aplicabilidade. O kit de ferramentas padrão consiste em várias peças intercambiáveis ​​(BioBricks) ⁹ abordando a conversão de alcanos, a regulação da expressão gênica e de sobrevivência em tóxicos hidrocarbonetos ambientes ricos.

Um percurso de três passos para a degradação alcano foi implementada em E. coli para permitir a conversão de alcanos de média e de cadeia longa para as suas respectivas alcanois, e, finalmente, alkanals alcanóico-ácidos. Este último foi metabolizada pela via β-oxidação nativa. Para facilitar a oxidação de alcanos de cadeia média (C5-C13) e os cicloalcanos (C5-C8), quatro genes (alkB2, rubA3, rubA4 e Rubb) do sistema de alcano-hidroxilase a partir de Gordonia sp. TF6 ^8,21 foram transformados em E. coli. Para a conversão dealcanos de cadeia longa (C15-C36), o gene a partir de Lada Geobacillus thermodenitrificans foi implementada. Para os passos necessários adicionais do processo de degradação, ADH e ALDH (proveniente G. thermodenitrificans) foram introduzidos ^10,11. A actividade foi medida por ensaios de células em repouso. Para cada passo de oxidação, a actividade da enzima foi observada.

Para optimizar a eficiência do processo, a expressão foi induzida somente em condições de glucose baixa: um promotor de substrato-regulado, pCaiF, foi usado. pCaiF está presente em E. coli K12 e regula a expressão dos genes envolvidos na degradação de fontes não-glicose de carbono.

A última parte do kit de ferramentas - visando a sobrevivência - foi implementado usando genes de tolerância de solventes, PhPFDα e β, ambos da Pyrococcus horikoshii OT3. Os solventes orgânicos podem induzir stress celular e diminuição da capacidade de sobrevivência por negativamente affecting enovelamento de proteínas. Como chaperones, PhPFDα e β melhorar o processo de dobragem de proteínas, por exemplo sob a presença de alcanos. A expressão destes genes conduziu a uma tolerância de hidrocarboneto melhorado mostrado por um aumento da taxa de crescimento (até 50%) na presença de 10% de n-hexano no meio de cultura foram observados.

Resumindo, os resultados indicam que o kit de ferramentas permite E. coli para converter e tolerar hidrocarbonetos em ambientes aquosos. Como tal, representa um primeiro passo para uma solução sustentável para o óleo-remediação utilizando uma abordagem de biologia sintética.

Introdução

A poluição por óleo está entre as causas mais graves de contaminação ambiental e afeta muito os ecossistemas, empresas e comunidades ³. As soluções são, por exemplo, necessárias para combater a poluição contínua por óleo originada das águas de rejeitos de areias betuminosas em Alberta, Canadá. Durante o processo de extração de petróleo de areias betuminosas, o betume, uma forma semissólida oxidada de petróleo, é removido usando técnicas de recuperação térmica que consomem cerca de 3,1 barris de água por barril de petróleo ¹. A água de processo contaminada com óleo, principalmente proveniente de um rio local, é armazenada em bacias de rejeitos após a extração de betume. É necessária uma reciclagem mais eficaz da água de processo, a fim de reduzir a necessidade de absorção de água doce. Para facilitar a extração de betume e garantir que os locais a jusante cumpram as diretrizes de qualidade da água para a proteção dos ecossistemas aquáticos, os tratamentos de água de processo estão evoluindo rapidamente ³.

Para tratar a poluição de compostos orgânicos, tecnologias de biorremediação que empregam microrganismos são atualmente incentivadas ¹. Os alcanos são a família de hidrocarbonetos mais abundante no petróleo bruto, contendo de 5 a 40 átomos de carbono por molécula ^{7, 21}. Muitas bactérias são conhecidas por degradar alcanos de vários comprimentos por meio da oxidação sequencial do grupo metil terminal, formando primeiro álcoois, depois aldeídos e, finalmente, ácidos graxos ⁸. Dentro deste projeto iGEM, várias enzimas de diferentes organismos foram expressas e caracterizadas e disponibilizadas por meio do padrão BioBrick e do Registro de Peças Biológicas Padrão.

O bem estudado sistema alcano hidroxilase de Gordonia sp. TF6 facilita a etapa inicial de oxidação dos alcanos C_{5-C 13} junto com a dos cicloalcanos C_{5-C 8} usando um mínimo de quatro componentes: alkB2 (alcano 1-monooxigenase), rubA3, rubA4 (duas rubredoxinas) e RubB (rubredoxina redutase) ^{8, 21}. A oxidação de alcanos de cadeia longa (variando de C₁₅ a C₃₆) é relatada como realizada por ladA, uma flavoproteína alcano monooxigenase de Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7^{, 15, 18, 22}. LadA forma um complexo catalítico com mononucleotídeo de flavina (FMN) que utiliza oxigênio atômico para oxidação. Isso resulta na conversão de alcanos no alcanol primário correspondente. Os álcoois são posteriormente oxidados por álcool e aldeído desidrogenase em ácidos graxos, que prontamente entram na via de β-oxidação ^{7, 21}. Uma álcool desidrogenase independente de zinco da bactéria termofílica Geobacillus thermoleovorans B23 oxida alcanois de cadeia média em seus respectivos alcanais, usando NAD⁺ como cofator ¹⁰. A aldeído desidrogenase da mesma bactéria é capaz de catalisar a etapa final dependente de NAD⁺ na oxidação de cadeia média ¹¹.

Com o objetivo de reduzir os custos de indução e manter a proliferação ideal do sistema bacteriano, foi caracterizado o promotor pCaiF de E.coli. Este promotor pode regular a expressão dos componentes da via de degradação dos hidrocarbonetos e é regulado pelos níveis de cAMP-Crp, que por sua vez dependem dos níveis de glicose ⁶. Em altas concentrações extracelulares de glicose no ambiente, o nível de cAMP celular (fosfato mononucleotídeo de adenosina cíclico) foi baixo devido à inibição da adenilil ciclase como efeito colateral do transporte de glicose mediado por PTS. Por outro lado, durante a limitação (baixas concentrações de glicose), o nível de cAMP aumentou e a PCR ligou-se ao cAMP formando o complexo cAMP-Crp, que se ligou ao pCaiF e ativou a transcrição dos componentes a jusante ^{6, 14}.

A E. coli de tipo selvagem só pode tolerar concentrações moderadas de hidrocarbonetos. Para completar o kit de ferramentas, a tolerância aos hidrocarbonetos teve que ser abordada. Sabe-se que várias bactérias tolerantes a solventes orgânicos sobrevivem em sistemas bifásicos ^{água-solvente 12}. Os componentes moleculares conhecidos por aumentar a tolerância são chaperonas que facilitam o dobramento correto das proteínas. O sistema pré-dobradina de Pyrococcus horikoshii OT3, consistindo nas proteínas phPFDα e phPFDβ, demonstrou aumentar a tolerância a hidrocarbonetos ¹⁷.

O kit de ferramentas de conversão de alcano foi construído seguindo o princípio BioBrick, que está documentado no Registro de Peças Biológicas Padrão ⁹. BioBricks são plasmídeos contendo um inserto funcional específico que é flanqueado por 4 locais de restrição predefinidos. As inserções BioBrick podem ser estendidas de forma flexível, permitindo a construção de sistemas biológicos com novas funções.

Protocolo

1. Biotijolo Assembléia

1. BioBricks do Registro de Standard partes biológicas são fornecidos pela sede iGEM. Para construir um novo a partir de biotijolo BioBricks existentes, digerir o doador biotijolo (até 1,0 ug) com as enzimas EcoRI e SpeI para posicionar os doadores jusante parte da parte de aceitador. Digest com Xbal e PstI para colocar a parte do doador a montante da parte aceitador. Adicionar uma enzima de restrição apropriada terceiro que corta na espinha dorsal do doador. Realizar as digestões num volume total de 20-25 ml com o tampão apropriado, de acordo com o fornecedor (concentração final de 1 x). Use 5 unidades / ug de ADN para as enzimas de restrição.
2. Digerir o biotijolo aceitador com um EcoRI e XbaI ou SpeI e PstI.
3. Incubar as digestões de (pelo menos) uma hora a 37 ° C. Inactivar as endonucleases de restrição por calor, a incubação a 80 ° C durante 10 min e centrifuga-se brevemente.
4. Ligar o biotijolo digeridopartes (dador e do aceitador) em conjunto. Desde XbaI e SpeI gerar extremidades de ADN compatíveis, um site misto é criado que não pode ser cortado com qualquer enzima de restrição resultando num novo biotijolo "combinado", que flanqueado por os 4 sítios de restrição padrão. Na mistura de ligação à concentração final de ADN é de preferência ~ 100 ng / uL. Realizar a reacção de ligação num volume total de 10-15 ml com o tampão de ligação T4 (concentração final de 1 x) e ligase de T4 (1 unidade / ug de ADN).
5. Incubar a mistura de ligação a 16 ° C durante pelo menos 3 horas.
6. Realizar a reacção de transformação de cerca de meia da mistura de ligação.
7. Confirme o biotijolo ser correto com o sequenciamento.
8. Para construir um novo biotijolo de ADN sintetizado, modificar os genes para a síntese para a expressão óptima em E. coli, por meio da ferramenta de website JCat ( http://www.jcat.de/ ). Fazer modificações adicionais, em conformidade com os requisitos da B ioBrick padrão. Esta padronização implica que cada biotijolo é composta de uma sequência de ADN de interesse precedido por um prefixo e seguido por um sufixo. O prefixo e sufixo são seqüências que contêm sítios de restrição predefinidos, que estão ausentes na sequência restante plasmídeo. Estes sítios de restrição padrão tornam possível trocar e estender as inserções biotijolo flexível ^9. O prefixo e sufixo têm as seguintes seqüências:

Nome	Seqüência	Comentário
Prefixo	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	Se a parte que se segue é uma sequência de codificação ou de qualquer parte que começa com "ATG"
Sufixo	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2. Conversão Alkane ensaio de células em repouso, In Vivo

Este ensaio foi realizado com base no método descrito por Fujii et al. (2004).

1. Cultura E. As células de E. coli que expressam o sistema Hidroxilase alcano ( BBa_K398014 ) e células transportando um vector vazio ( BBa_J13002 ) em 5 ml de meio LB com antibióticos apropriados durante a noite.
2. Transferir 500 uL da cultura durante a noite em 50 ml de LB fresco (com antibiótico) e incubar até a turbidez celular atingiu uma DO (densidade óptica) de 0,3 a 600 nm.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 4.000 rpm e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4).
4. Centrifugar novamente durante 10 min a 4.000 rpm e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão fosfato 0,1 M contendo agora sais de E2 e 0,66% de glicerol v / v (azoto-defit médio).
5. Medir a turbidez da célula (OD _600).
6. Prepare célula mistura-se alíquotas de 6 ml em frascos de 25 ml fechado de tampão de vidro e não de células controles (sais de E2 + 0,66% de glicerol v / v).
7. Adicionar 100 nmol de alcano a cada frasco.
8. Incubar as misturas a 37 ° C durante 24 horas (quando diminuir as taxas mais elevadas obtêm-se).
9. Medir a OD ₆₀₀ após incubação.
10. Extrair os hidrocarbonetos no meio de cultura com acetato de etilo e determinar a concentração de hidrocarboneto em cultura celular por cromatografia gasosa (ver protocolo 3).
11. Calcula-se a degradação por unidade de biomassa através da divisão da quantidade total de alcano convertido pela biomassa total presente em cada frasco (converter OD ₆₀₀ de peso seco). Dividindo o resultado pela duração experimental produz a actividade de degradação por unidade de biomassa por unidade de tempo. A média é calculada a partir de três experiências individuais.

3. Alcano Ensaio Enzima de conversão, emVitro

Este ensaio foi efectuado essencialmente de acordo com o método descrito por Li et al. (2008).

1. Cultura E. As células de E. coli que expressam o gene Lada ( BBa_K398017 ) e células portadoras de um vector vazio ( BBa_J13002 ) em 50 ml de meio LB com antibióticos apropriados durante a noite.
2. Transferir 500 uL da cultura durante a noite em 50 ml de LB fresco (com antibiótico) e incubar até a turbidez celular atingiu uma densidade óptica de 0,6 a 600 nm.
3. Centrifugar 10 min a 4000 rpm (4 ° C) e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão Tris 50 mM.
4. Sonicado (disruptor celular, LA Biosystems), as células no ciclo de trabalho de 40%, com um controlo de saída de 4, manter a solução em gelo durante todo o período.
5. Centrifugar a mistura resultante durante 5 min a 4000 rpm a 4 & dpor exemplo, C para remover os restos celulares. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
6. Determinar a concentração de proteína total dos extractos de células por ensaio de Bradford. Nota: Utilizar frascos de vidro para evitar o crescimento de fundo e / ou a perda de proteínas.
7. Prepara-se uma mistura de 100 ml contendo 0,1% v / v de alcano e 50 mM de tampão Tris-HCl.
8. Aquecer a mistura a 100 ° C durante 5 min. Nota: Realize esta etapa apenas para alcanos médio de cadeia longa, com alto ponto de ebulição. (Por exemplo, C _16: 287 ° C).
9. Para alcançar uma solubilidade óptima do alcano, sonicar durante 1 min, enquanto ainda quente, até uma mistura viscosa homogénea é obtida.
10. Adicionar 1 mM de NADH, 1 mM de FMN, 1 mM de MgSO ₄ e 0,01 v / v de Triton X-100.
11. Prepare 6 alíquotas ml em 25 ml-tampão fechado frascos.
12. Adicionar a quantidade adequada de extracto de células (dependendo do ensaio de Bradford, à concentração final de 5 mg de proteína / l). Prepare um controle não-proteína.
13. Incubar a 60 ° C (para e óptimanzymatic actividade) durante 24 h.
14. Extrair os hidrocarbonetos no meio de cultura com acetato de etilo e determinar a concentração de hidrocarboneto em cultura celular por cromatografia gasosa (ver protocolo 3).
15. Calcula-se a degradação por unidade de biomassa através da divisão da quantidade total de alcano convertido por proteína total adicionado a cada frasco (por Bradford curva de calibração). Além disso dividindo por a duração da experiência produz a actividade de degradação por unidade de proteína celular por unidade de tempo. A média é calculada a partir de três experiências individuais.

4. Extração de hidrocarbonetos e acetato de medições de concentração

1. Alcanos são extraídos a partir da solução aquosa por adição de 2,5 ml de acetato de etilo (Solvant apolar) a 6 ml de solução experimental. Um padrão interno é adicionado ao solvente, a uma concentração de 0,1% (v / v). O padrão (por exemplo, ciclo-decan) pode variar dependendo da gama esperada dos picos de interesse.
2. Opcional: Adicionar TritonX-100 à mistura aquosa e centrifugar as amostras durante 10 min a 4000 rpm a fim de obter um sistema bi-fásico adequado.
3. Vortex a mistura durante 5 seg (1.500 rpm) e incuba-se à temperatura ambiente até as duas fases separadas.
4. Remover uma quantidade máxima da camada orgânica (superior) e secar-se o solvente sobre sulfato de magnésio anidro.
5. Remover _MgSO4 por filtração (0,2 um) e transferir o filtrado para frascos cromatógrafo de gás para as medições, ou armazenar a -20 ° C.
6. Determinar a concentração por meio de cromatografia gasosa utilizando uma coluna CP-SIL 5CB (comprimento = 5 m). Injectam-se 10 ul de amostra no modo de divisão (1:10, 230 ° C). Definir o fluxo de gás de coluna a 1 ml / min (hélio). O seguinte programa de temperaturas do forno é usado:

   Taxa	Temperatura [° C]	Tempo [min]
   0	50	7,5
   50	90	1,0
   50	110	2,0
   50	130	2,0
   50	145	2,0
   50	160	2,0
   50	170	2,0
   50	185	2,0
   50	210	2,0
   50	250	2,0
   50	320	2,0

7. Integrar os picos e corrigir as concentrações em relação ao padrão interno.

5. Álcool / aldeído desidrogenase Ensaio

Este ensaio foi efectuado essencialmente de acordo com o método descrito por Kato et al.(2010).

1. Cultura E. As células de E. coli que expressam o ADH ( BBa_K398018 ) ou ALDH ( BBa_K398030 gene) e células portadoras de um vector vazio ( BBa_J13002 ) em 50 ml de meio LB com antibióticos apropriados durante a noite.
2. Transferir 500 uL da cultura durante a noite em 50 ml de LB fresco (com antibiótico) e incubar até a turbidez celular atingiu uma densidade óptica de 0,6 a 600 nm.
3. Centrifugar 10 min a 4.000 rpm a 4 ° C e ressuspender o sedimento em 5 ml de 50 mM de tampão Tris.
4. Sonicar a solução de células no ciclo de trabalho de 40% com um controlo de saída de 4 (manter a solução em gelo durante a sonicação).
5. Centrifugar a mistura resultante durante 5 min a 4000 rpm a 4 ° C para remover os restos celulares.
6. Para determinar oconcentração de proteína tal dos extractos celulares pelo ensaio de Bradford (Nota: utilizar um frasco de vidro para prevenir a ligação da proteína).
7. Carregar uma placa de 96 poços com 180 ul de 57 mM de tampão de glicina contendo NAD (concentração final 1 mM, pH 9,5) em cada poço.
8. Adicionam-se 5 ul de álcool (aldeído) a ser testado para os poços. Nota: os álcoois de cadeia longa de calor antes do início do ensaio, para ter um líquido. Para cada álcool (aldeído) um controlo sem substrato deve ser adicionado (controlo negativo). Além disso, preparar um branco contendo uma mistura de solução tampão e do substrato, sem extracto celular.
9. Pré-aqueça o prato de o leitor de placas (Tecan Magellan v7.0) durante 15 min a 37 ° C para permitir o equilíbrio do sistema.
10. Adicionar a quantidade adequada de extracto de células (dependendo do ensaio de Bradford, à concentração final de 5 mg de proteína / l). Prepare um controle não-proteína.
11. Medir a produção de NADH utilizando um espectrofotómetro a um comprimento de onda de 340 nm a cada 2-3 min durante 1 hora a 37 ° C.
12. Calcula-se a taxa de produção de NADH a partir do declive da DO (340 nm). Leve em conta o comprimento do caminho de luz e coeficiente de extinção do NADH de 6220 M ^-1 cm ^-1. Dividir a taxa de produção de NADH com a quantidade total de proteína adicionada para expressar a actividade da reacção de desidrogenase no extracto celular (U / mg de proteína celular total). Calcula-se a média e o desvio padrão de três experiências independentes.

6. Caracterização pCaiF

1. Cultura E. As células de E. coli que expressam a construção pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) e as células que transportam o promotor sozinho ( BBa_K398326 ) durante a noite em 5 ml de meio LB durante a noite os antibióticos apropriados.
2. Inocular 5 ml M9 contendo glicose a 10 g / l e os antibióticos, com 50 uL da cultura durante a noite e crescer durante a noite.
3. Ul subcultura 50 da excrescência durante a noite em 5 ml de fresco M9 with10 g / l e incubado até a turbidez celular atingiu uma densidade óptica de 0,2 a 600 nm.
4. Carregar uma placa de 96 poços com 100 ul de meio M9 fresco contendo a quantidade desejada de fonte de carbono para testar em cada poço. Realizar ensaios em triplicado para a avaliação estatística e adicionar os respectivos controlos negativos (de tipo selvagem de E. coli K12).
5. Adicionam-se 5 ul da cultura durante a noite para os poços contendo meio.
6. Medir a curva de crescimento (DO ₆₀₀₎ e GFP de fluorescência (485 nm de excitação e de emissão de 520), utilizando um leitor de placas a cada 10 min durante 18 horas a 37 ° C com agitação constante.
7. Calcula-se a taxa de crescimento e o teor de GFP específica a partir das medições respectivas e comparar com o controlo. Calcula-se a média e o desvio padrão de pelo menos três experiências independentes.

7. Ensaio de tolerância

1. CulturaE. coli expressando o gene PhPFDα e β ( BBa_K398406 ) durante a noite em 5 ml de meio LB e os antibióticos apropriados. E. coli que expressam Lada gene ( BBa_K398017 ) é utilizado como controlo negativo.
2. Ul subcultura 10 da excrescência durante a noite em 5 ml de LB fresco (com antibiótico) e incuba-se até que a turbidez celular atingiu uma densidade óptica de 0,3 a 0,4 a 600 nm.
3. Diluir as culturas com meio fresco até uma OD ₆₀₀ de 0,1 seja alcançado.
4. Carregar uma placa de 96 poços com 180 ul de meio M9 contendo os antibióticos adequados e a concentração final apropriada do composto tóxico (por exemplo, 0, 4, 8, 10% de n-hexano), em triplicado. Porque alcano-misturas de água pode levar a sistemas de duas fases é essencial ter controlos apropriados na placa (por exemplo, dcepas iferentes e as experiências respectivas em branco).
5. Adicionar 20 ul da cultura (controlo) nos poços.
6. Medir a concentração da biomassa (OD _600), utilizando um leitor de placas a cada 10 min durante 24 h, a 37 ° C com agitação constante.
7. Calcular as taxas de crescimento a partir das medições para as respectivas concentrações de agentes diferentes e comparar com o controlo negativo. Calcula-se a média e o desvio padrão de pelo menos três experiências independentes.

8. Mapeamento de Interação homólogo

1. O aplicativo foi desenvolvido ELE para realizar consultas de proteína em um servidor de banco de dados PostgreSQL executando a STRING (grátis para uso acadêmico) ^20. O homólogo aplicativo de mapeamento interação identifica proteínas interagem no organismo hospedeiro original, usando o banco de dados STRING. As sequências dos genes respectivos que interagem são utilizadas numa pesquisa BLAST para encontrar genes homólogos no organismo alvo. Cytoscape ⁴ é usada para visualizar o resultado do mapeamento. A ferramenta de software ele pode ser baixado em: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. Para realizar um mapeamento, (1) inserir a ID biotijolo ea aplicação irá baixar automaticamente os dados das peças de seqüência do registro de Standard Partes Biológicas ^9, ou (2) entrar (colar) os dados de seqüência na aplicação.
3. Use o site banco de dados STRING para encontrar o ID de proteínas STRING para a seqüência de ácido amino entrou.
4. Uma proteína com alta homologia é determinada utilizando BLAST. Subsequentemente, a aplicação relaciona cada proteína interagindo conhecida no organismo fonte e procura por homólogos no organismo hospedeiro (por exemplo, E. coli).
5. Exportar lista interação resultante putativo de texto ou Cytoscape.

Resultados

Conversão de alcanos

A atividade das três etapas de oxidação do alcano ao respectivo ácido graxo foi avaliada por meio de ensaios de células em repouso e medidas de atividade enzimática. Os resultados são apresentados seguindo as reações da via (1) alcano hidroxilase, (2) álcool desidrogenase e (3) aldeído desidrogenase.
Para a primeira etapa, diferentes plasmídeos foram construídos para alcanos de cadeia média e longa. O plasmídeo

Discussão

O princípio biotijolo é utilizado para construir um chassis para a degradação dos alcanos e uma prova de princípio para os componentes individuais da caixa de ferramentas foi obtido. Os ensaios são propostas diversas para medir a in vivo e in vitro a actividade de enzimas da via de alcano degradantes. O trabalho apresentado demonstra com sucesso um número de métodos que podem ser usados ​​para determinar as actividades enzimáticas e de expressão do organismo hospedeiro E. coli após a implement...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecano	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexano	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Cromatógrafo
Disruptor celular	LA Biosystems	CD-019
Espectrofotômetro	Amersham pharmacia	spec 2000
Leitor de placas	Tecan Group Ltd.	Incubadora Magellan v7.0
	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças	Biológicas PadrãoBBa_K398014	Alkane Hydroxylase System Resistência: Cloranfenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Universidade de Tecnologia de Delft no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças	Biológicas PadrãoBBa_K398027	ladA Gerador de Proteínas Resistência: Cloranfenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Universidade de Tecnologia de Delft no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças	Biológicas PadrãoBBa_K398018	ADH generator Resistência: Cloranfenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Universidade de Tecnologia de Delft no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças	Biológicas PadrãoBBa_K398030	ALDH generator Resistência: Cloranfenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Universidade de Tecnologia de Delft no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças Biológicas Padrão	BBa_K398326	pCaiF promoter Resistência: Cloranfenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Universidade de Tecnologia de Delft no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças Biológicas Padrão	BBa_K398331	pCaiF dispositivo de medição Resistência: Cloranfenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107-	Universidade de Tecnologia de Delft no departamento de Biotecnologia ou Registro de Peças Biológicas Padrão	BBa_K398406	Cluster de tolerância a solventes Resistência: Cloranfenicol