Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

Eva K. Brinkman; Kira Schipper; Nadine Bongaerts; Mathias J. Voges; Alessandro Abate; S. Aljoscha Wahl

doi:10.3791/4182

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Artigo de método

Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

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DOI:

10.3791/4182

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2 de outubro de 2012

Eva K. Brinkman¹ , Kira Schipper¹ , Nadine Bongaerts¹ , Mathias J. Voges¹ , Alessandro Abate² , S. Aljoscha Wahl¹

¹Department of Biotechnology, Delft University of Technology, ²Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

Neste artigo

Resumo

A auto sustentável regulação sistema bacteriano para a remediação de contaminações de óleo foi desenhado usando o padrão partes do DNA intercambiáveis (BioBricks). Uma engenharia E. coli foi usada para degradar a alcanos via β-oxidação em ambientes aquosos tóxicos. As enzimas respectivos de diferentes espécies mostraram atividade de degradação alcano. Além disso, um aumento da tolerância ao N-Hexano foi conseguida através da introdução de genes a partir de alcano-tolerantes bactérias.

Resumo

Este trabalho apresenta um conjunto de ferramentas que permite a conversão de alcanos por Escherichia coli e apresenta uma prova de princípio de sua aplicabilidade. O kit de ferramentas padrão consiste em várias peças intercambiáveis (BioBricks) ⁹ abordando a conversão de alcanos, a regulação da expressão gênica e de sobrevivência em tóxicos hidrocarbonetos ambientes ricos.

Um percurso de três passos para a degradação alcano foi implementada em E. coli para permitir a conversão de alcanos de média e de cadeia longa para as suas respectivas alcanois, e, finalmente, alkanals alcanóico-ácidos. Este último foi metabolizada pela via β-oxidação nativa. Para facilitar a oxidação de alcanos de cadeia média (C5-C13) e os cicloalcanos (C5-C8), quatro genes (alkB2, rubA3, rubA4 e Rubb) do sistema de alcano-hidroxilase a partir de Gordonia sp. TF6 ^8,21 foram transformados em E. coli. Para a conversão dealcanos de cadeia longa (C15-C36), o gene a partir de Lada Geobacillus thermodenitrificans foi implementada. Para os passos necessários adicionais do processo de degradação, ADH e ALDH (proveniente G. thermodenitrificans) foram introduzidos ^10,11. A actividade foi medida por ensaios de células em repouso. Para cada passo de oxidação, a actividade da enzima foi observada.

Para optimizar a eficiência do processo, a expressão foi induzida somente em condições de glucose baixa: um promotor de substrato-regulado, pCaiF, foi usado. pCaiF está presente em E. coli K12 e regula a expressão dos genes envolvidos na degradação de fontes não-glicose de carbono.

A última parte do kit de ferramentas - visando a sobrevivência - foi implementado usando genes de tolerância de solventes, PhPFDα e β, ambos da Pyrococcus horikoshii OT3. Os solventes orgânicos podem induzir stress celular e diminuição da capacidade de sobrevivência por negativamente affecting enovelamento de proteínas. Como chaperones, PhPFDα e β melhorar o processo de dobragem de proteínas, por exemplo sob a presença de alcanos. A expressão destes genes conduziu a uma tolerância de hidrocarboneto melhorado mostrado por um aumento da taxa de crescimento (até 50%) na presença de 10% de n-hexano no meio de cultura foram observados.

Resumindo, os resultados indicam que o kit de ferramentas permite E. coli para converter e tolerar hidrocarbonetos em ambientes aquosos. Como tal, representa um primeiro passo para uma solução sustentável para o óleo-remediação utilizando uma abordagem de biologia sintética.

Introdução

A poluição por óleo está entre as causas mais graves de contaminação ambiental e afeta grandemente ecossistemas, empresas e comunidades ³. São necessárias soluções, por exemplo, para combater a poluição contínua por óleo proveniente das águas residuais de areias betuminosas em Alberta, Canadá. Durante o processo de extração de óleo das areias betuminosas, o betume, uma forma semi-sólida e oxidada de óleo, é removido utilizando técnicas de recuperação térmica que consomem cerca de 3,1 barris de água por barril de óleo produzido ¹. A água residual contaminada com óleo, proveniente principalmente de um rio local, é armazenada em lagoas de rejeito ap....