Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Resumo

Uma ferramenta e químicas são descritos para sequencialmente isolar os ácidos nucleicos, seguido por proteínas a partir de uma amostra sem a necessidade de electricidade. A ferramenta é constituída por um sorvente realizada dentro de uma pipeta de transferência, enquanto os produtos químicos de isolamento são baseado em princípios de fase sólida de extracção. As macromoléculas isoladas podem ser analisados ​​através de ensaios de imuno-base e baseado em PCR.

Resumo

Patógenos tradicionais e emergentes, tais como Escherichia coli entero (EHEC), Yersinia pestis, ou príon baseados doenças são de grande preocupação para governos, indústrias e profissionais da área médica em todo o mundo. Por exemplo, EHECs, combinados com Shigella, são responsáveis ​​pelas mortes de aproximadamente 325.000 crianças a cada ano e são particularmente prevalentes no mundo em desenvolvimento, onde baseado em laboratório de identificação, comum nos Estados Unidos, não está disponível ^1. O desenvolvimento ea distribuição de baixo custo, baseados em campo, ponto-de cuidados de ferramentas para ajudar na identificação rápida e / ou diagnóstico de patógenos ou marcadores de doença poderia alterar drasticamente a progressão da doença eo prognóstico do paciente. Nós desenvolvemos uma ferramenta para isolar os ácidos nucleicos e proteínas a partir de uma amostra por extracção em fase sólida (SPE) sem electricidade ou equipamento associado laboratório ^2. As macromoléculas isolados podem ser utilizados para diagnósticosis quer em um laboratório para a frente ou usando campo baseados no ponto-de-cuidado plataformas. É importante ressaltar que este método prevê a comparação direta de ácidos nucléicos e proteínas de dados a partir de uma amostra não-divisão, oferecendo uma confiança através de comprovação de análise genômica e proteômica.

A nossa ferramenta de isolamento utiliza o padrão da indústria de fase sólida para o isolamento de ácido nucleico, a tecnologia BOOM, que isola os ácidos nucleicos a partir de uma solução de sal caotrópico, geralmente isotiocianato de guanidina, através da ligação a base de sílica partículas ou filtros ^3. Química CUBRC de extracção em fase sólida de propriedade é usado para purificar a proteína a partir de soluções de sal caotrópicos, neste caso, a partir dos resíduos ou de fluxo através após isolamento de ácido nucleico ^4.

Por uma embalagem bem caracterizado químicas em uma plataforma de pequeno, barato e simples, que geraram um sistema portátil para a extracção de ácido nucleico e proteína que pode ser realizado sob uma variety de condições. Os ácidos nucleicos isolados são estáveis ​​e podem ser transportados para uma posição onde a energia está disponível para amplificação por PCR, enquanto o teor de proteína pode ser imediatamente analisadas por mão ou outros imunológica ensaios baseados. A rápida identificação de marcadores de doenças no campo poderiam alterar significativamente o resultado do paciente, orientando o curso apropriado do tratamento em um estágio anterior de progressão da doença. A ferramenta e método descritos são adequados para utilização com virtualmente qualquer agente infeccioso e dar ao utilizador a redundância de análises de tipo multi-macromolécula, reduzindo simultaneamente a sua carga logístico.

Protocolo

1. Lise da amostra

1. As amostras devem ser em forma líquida. Se a amostra é sólida, por exemplo alimentos ou fezes, a amostra deve ser suspenso num meio líquido tal como água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Misturar 500 uL da amostra com 500 uL de tiocianato de guanidina 6M (pH 6,5) em um tubo de 1,5 ml.
3. Deprimir a lâmpada de uma pipeta de extracção, expulsando o ar ambiente.
4. Puxar a amostra mL inteiro 1 para a pipeta de extracção, ao longo do material sorvente, permitindo que a lâmpada lentamente expandir.
5. Inverta a ferramenta de extracção de tal modo que as pérolas de adsorvente e de drenagem de amostra no bolbo.
6. Moer os grânulos absorventes com a amostra na ampola com cuidado para não expelir a amostra para fora da pipeta de extracção.

2. Extracção de ácido nucleico (Figura 1, Painel A)

1. Inverta a pipeta de extracção (a abertura para baixo) e expelir a amostra para o tubo mL inicial de 1,5.
2. Puxar o inteiro 1 mL de amostra para a pipeta de extracção, que passa sobre o adsorvente, a uma taxa moderada, tomando cuidado para manter o sorvente no pescoço da pipeta de extracção.
3. Expulsar toda a amostra dentro do tubo de 1,5 mL, pressionando o bulbo.
4. Repetir os passos 2.2 e 2.3, passando a amostra ao longo dos sorventes mais quatro vezes para um total de 5 passagens.
5. Após a passagem através da quinta sorvente, expelir o inteiro 1 mL de amostra em 4mL de tampão de extracção de proteína (em um tubo cónico de 15 mL), fechar o tubo, e retiradas para utilização posterior.
6. Lavar os ácidos nucleicos isolados por passagem de 1 mL de etanol a 95% ao longo dos sorventes três vezes, voltando o etanol, para o seu tubo original mediante passagem final.
7. Repetir o passo 2,6 utilizando uma mL de 1 segundo, de lavagem etanol a 95%.
8. Pressione e solte a lâmpada por 5 minutos, passando do ar ambiente em toda a pipeta de extração para secar os ácidos nucléicos Pensão sorvente. Wipe etanol residual a partir da ponta da pipeta extracção ucantar uma Kimwipe.
9. Recuperar os ácidos nucleicos por passagem 250 uL de 10 mM Tris (pH 6,8) ao longo dos sorventes cinco vezes. O tampão de Tris pode ser substituído por qualquer outra solução apropriada aquoso tal como PBS. A solução resultante contém os ácidos nucleicos extraídos.

3. Extracção de proteína (Figura 1, Painel B)

1. Misturar a amostra e proteína tubo tampão de extracção a partir do passo 2,5 por inversão e passar aproximadamente 2-3 mililitros desta amostra de 5 mL ao longo do sorvente de uma pipeta de extracção novo.
2. Expelir toda a amostra para o tubo de 15 mL mesma cónica tendo o cuidado de manter o sorvente no pescoço da pipeta de extracção.
3. Repetir os passos 3.1 e 3.2, passando a amostra ao longo dos sorventes 15 vezes.
4. Lavar o sorvente ea proteína ligada por passagem de 1 mL de etanol a 95% em relação ao leito adsorvente, três vezes, etanol a ejectar em que o tubo original.
5. Repetir o passo 3,4 utilizando uma mL de 1 segundo, de lavagem etanol a 95%.
6. Prima e liberte a lâmpada durante 5 minutos, passando o ar ambiente por toda a pipeta de extracção para secar a proteína / leito adsorvente. Wipe etanol residual a partir da ponta da pipeta de extracção utilizando um Kimwipe.
7. Recuperar a proteína por passagem 250 uL de PBS ao longo dos sorventes cinco vezes. O tampão PBS pode ser substituído por qualquer outra solução apropriada aquoso, tal como 10 mM de Tris (pH 6,8). A solução resultante contém o teor de proteína da amostra.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

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Figura 5.

Resultados

Isolamento de ácido nucleico: ácidos nucleicos isolados são PCR amplificável e livre de contaminação de proteína.

Exemplo 1: Os ácidos nucleicos recuperados são adequados para utilização na PCR aplicações baseadas. Por exemplo, a Figura 2 mostra a amplificação de genes associados a toxina Shiga entero E. coli O157: H7 estirpe EDL-933 (ATCC # 35150) de um procedimento de extracção de ácido nucleico / proteína utilizando a pipeta de extracção. Os genes toxina Shiga stx 1 e stx 2 são encontrados em bacteriófago lambda do tipo temperado e com defeito bacteriófago nesta e em outras entero E. coli sob o controlo do promotor P _R ^{5 6 7 8.} A ativação da resposta SOS em E. coli leva a profago indução e / ou a produção de toxina ^9. Nós utilizada uma versão modificada do ensaio de PCR multiplexado por Feng et ai. ¹1 para identificar a stx 1 e stx 2 genes, tanto em cultura e as amostras de esgoto perfurantes. As pistas A e B na Figura 2 mostram os resultados de uma amplificação por PCR de uma amostra de cultura não transformadas (pista A) e uma amostra de cultura processado (pista B). Estes resultados são significado praticamente idêntico, não há perda de fidelidade nos ácidos nucleicos transformados ou isolado. A seguir, amplificado esgoto enriquecido (pista D) ou ácidos nucleicos isolados de esgoto enriquecido (pistas E & F). Estes dados indicam que os ácidos nucleicos isolados resultou em maior amplificação versus os ácidos nucleicos não isoladas a partir de amostras de esgoto perfurantes. Concluímos, portanto, que os inibidores de PCR quer naturalmente encontrados no esgoto foram removidos no isolamento ou que os ácidos nucleicos foram concentrados no isolamento. Uma combinação destas duas hipóteses é também possível.

Espectroscopia de ultravioleta foi próxima usado para mostrar que os ácidos nucleicos isolados eram relativamente livre oproteína f contaminante. A Figura 3 mostra os espectros de UV de dois E. isolamento de ácido nucleico H7 extracções, rotulados e um b isolamento, em comparação com o espectro normalizado da cultura bacteriana, rotulada isolamento do pré-: coli O157. Os espectros de UV dos ácidos nucleicos isolados semelhante à espectros de puras ácidos nucleicos, tendo uma proporção calculada de absorvância entre 260 nm e 280 nm que se aproximam 1,8 ^10. Estes dados mostram que há muito pouca proteína contaminante na fracção de ácido nucleico recuperado utilizando a técnica descrita.

Isolamento da proteína: proteína recuperado a partir da experiência de isolamento de ácido nucleico / proteína é imunorreactivo e electroforeticamente idêntica à proteína pura.

Exemplo 2: A fracção de proteína isolada foi aplicada ao E. RapidChek coli O157 tiras de fluxo lateral de ensaio (SDIX, Inc.). Controles de mostrar uma identificação positiva em todas as amostras que abrigam E. coli O157, com ou sem STX indução (Figura 4, pistas B e C, respectivamente). Os dados na Figura 4 também mostram resultados positivos para as amostras que albergam E. coli O157 que foram processados ​​para ácidos nucleicos e então a proteína utilizando a pipeta de extracção. Estes dados mostram que a proteína isolada a partir de cada amostra é imunoreactivo desencadeando assim uma resposta positiva.

A amplificação por PCR (como descrito no Exemplo 1) foi realizada sobre as amostras de proteína para mostrar que a fracção de proteína isolada era desprovido de contaminantes ácidos nucleicos. Os resultados para estes experimentos foram todos negativos por eletroforese em gel. Assim, conclui-se que o teor de proteína da amostra foi separada a partir de ácidos nucleicos contaminantes. Estes resultados, tomada em conjunto com as descritas para o passo de ácido nucleico mostram que o isolamento dos ácidos nucleicos e teor de proteína são isolados em passos de fraccionamento separadas.

t "> Exemplo 3:. A proteína isolada é adequado para electroforese ¹⁰ A Figura 5 representa uma coomassie coradas gel de acrilamida a 8% carregado com BSA (Figura 5, pistas A e C) e BSA isolado a partir de 6M isotiocianato de guanidina utilizando a extracção pipeta e associado protocolo. A mobilidade electroforética da proteína isolada é idêntica à das amostras de controlo. Concluímos daí que o processo de extracção não altera a estrutura covalente da proteína isolada.

Figura 1, Painel A: Representação de um procedimento de extracção de ácido nucleico típico A amostra é misturada com tiocianato de guanidina 6M no tubo de amostra e passada ao longo dos sorventes cinco vezes.. Após a última passagem, a amostra é adicionada ao tampão de extracção de proteínas. Os ácidos nucleicos sorventes e acoplado são lavadas duas vezes com etanol. A amostra é então ar dRied e eluiu-se a partir do adsorvente.

A Figura 1, Painel B: Representação de um procedimento típico da proteína de extracção A amostra misturada com tampão de isolamento de proteínas a partir do passo 1, a Figura 1, painel A é passado sobre o sorvente de uma pipeta de extracção segundo 15 vezes.. O resto do procedimento é idêntico ao do protocolo de extracção de ácido nucleico.

Figura 2:. Imagem negativa de um brometo de etídio gel de agarose corado Um multiplexados toxina Shiga 1 e 2 experimento amplificação do gene foi realizada utilizando amostras de cultura (pistas A e B) ou de amostras de esgoto em bruto dopada com E. coli O157: H7 (pistas D, E e F). As amostras foram, quer directamente adicionado a um tubo de reacção de PCR (pistas A e D) ou as amostras foram processadas utilizando o proces isolamentos, e os ácidos nucleicos extraídos foram adicionados ao tubo de reacção de PCR (Amostras B, E e F). O protocolo de PCR é uma modificação do descrito por Feng et al ^11. Nossa modificação alvo apenas aqueles amplificado pelo stx 1 (banda inferior) e stx 2 (banda superior) pares de primers, abandono todos os pares de primers outros. Pista C é a escada 1Kb da BioRad.

Figura 3: Os resultados de espectroscopia de UV de E. coli O157: H7 ácidos nucleicos isolados utilizando a pipeta de extracção relatado Os ácidos nucleicos isolados são rotulados isolamento e uma b isolamento.. O espectro de UV da amostra foi também testada antes da extracção de ácido nucleico e é rotulado pré-isolamento. Os espectros foram obtidos utilizando um Espectrofotómetro Hitachi U3010 e associados pacote de software.

Figura 4:. Foto cor de tiras de teste RapidChek O conteúdo de proteína das amostras utilizadas na Figura 2 foi isolado utilizando a pipeta de extracção e testados para a imuno-reactividade por ensaio de fluxo lateral. Lanes AC são controlos não transformados, que é, a cultura de células foi adicionado para a tira de teste sem ácido nucleico ou de extracção de proteínas. Pista A é E. coli BL21 DE3 pLysS como um controlo negativo, Lanes B e C mostram E. coli O157: H7 que não foi tratado (B), ou tratadas com mitomicina C durante 4 horas (C). Lanes D através de H mostram os resultados da adição da proteína extraída para as tiras de teste de fluxo lateral. Lanes D e E foram sondadas utilizando o extracto de proteína a partir de E. coli BL21 DE3 pLysS, quer sem (D) ou com mitomicina C tratamento (E) como controlos negativos. Lanes FH mostrar os resultados quando extraído de proteínas de E. coli O157: H7 foi usado. A proteína foi extraída não tratado (F), ou a partir de 2 horas (G) ou 4 horas (H) da mitomicina C culturas tratadas.Os resultados positivos produzir uma linha dupla vermelha.

Figura 5:. A fotografia de um corado com Coomassie SDS-PAGE BSA foi isolado a partir da solução utilizando a pipeta de extracção e protocolos descritos. As pistas A e C são faixas de controlo de 250 ug / mL e 500 ug / mL, respectivamente. Lanes B e D representam BSA recuperado a partir de soluções contendo as mesmas concentrações como os seus respectivos controlos.

Discussão

As ferramentas, químicas e protocolo descrito no presente relatório representa o primeiro exemplo conhecido de uma electricidade livre de sistema de extracção, multi-macromolécula que pode ser utilizada no campo, baseadas em ponto de cuidados de aplicações. Ambos os tipos macromolécula pode ser aplicado a um número de dispositivos de diagnóstico ou a jusante analítica. Por exemplo, os ácidos nucleicos isolados são de PCR de qualidade (Figura 2 e 3), enquanto o componente de proteína da amostra é imunoreactivo (Figura 4). A utilização deste sistema de extracção em austeros ou recurso áreas limitadas do mundo poderia reduzir drasticamente a carga de doenças nas populações que ali vivem. Este sistema de extracção também podem ajudar em programas de doenças de vigilância em todo o mundo, fornecendo um método robusto ainda rápida e de custo eficaz para o processamento de amostras em locais inóspitos ou remotos.

Um aspecto importante para o método de extracção descrito acima é queele pode ser modificado pelo utilizador. Por exemplo, nos casos em que o tamanho da amostra é maior ou menor do que os iniciais 500 μLs (passo 1.2), o utilizador pode ajustar os volumes dos reagentes em conformidade. Isto é, a relação volumétrica dos reagentes para o tamanho da amostra deve permanecer constante enquanto os volumes absolutos podem ser alteradas. Além disso, os ajustes no número de passagens durante o sorvente pode também ser feita à discrição do utilizador. Por exemplo, se um volume de amostra maior é usado, passando a amostra ao longo dos tempos sorventes mais do que listadas (passos 2.4 e 3.3) vai aumentar a probabilidade de o tipo de macromolécula (ácido nucleico ou proteína) o contacto do sorvente. O aumento nas passagens deve aumentar a eficiência capturar até à saturação sorvente é atingido.

Nós descobrimos que a ferramenta de extracção e de produtos químicos associados têm algumas limitações, sendo o mais significativo dos quais é que a química de extracção de proteína é ineficiente para a recuperação de altamente glicosiladaproteínas. No caso em que o diagnóstico jusante ataca uma proteína glicosilada, este sistema não pode ser ideal para a identificação. Além disso, os limites superior e inferior da eficiência de extracção, quer para ácidos nucleicos ou proteínas ainda estão a ser determinado, e optimização está em curso para maximizar a eficiência de recuperação. Maior desenvolvimento da ferramenta irá superar estas lacunas de conhecimento atuais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Tiocianato de guanidina	Teknova	G4000
etanol	Pharmco-Aaper	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma	A-4503