Purificação e Agregação do Domínio proteína precursora de amilóide intracelular

Resumo

Um método para a purificação em larga escala do domínio intracelular de APP (AICD) é descrita. Nós também descrevem metodologia de indução In vitro Agregação AICD e visualização por microscopia de força atômica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica / estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares sobre a sua agregação.

Resumo

Proteína precursora amilóide (APP) é uma proteína transmembranar de tipo I associado à patogénese da doença de Alzheimer (AD). APP é caracterizada por um grande domínio extracelular e um domínio citosólico curto denominado o domínio intracelular de APP (AICD). Durante a maturação através da via secretora, APP pode ser clivada por proteases denominadas α, β e γ-secretases ^1. A clivagem proteolítica da APP sequencial com β e γ-secretases conduz à produção de um péptido pequeno proteolítico, denominado de Ap, que é amiloidogénica e o constituinte principal das placas senis. A AICD também é libertada a partir da membrana, após o processamento secretase, e por meio de interacções com Fe65 e Tip60, pode translocar para o núcleo para participar na regulação da transcrição de genes alvo múltiplas ^2,3. Interacções proteína-proteína envolvendo a AICD podem afectar o tráfico, o processamento e as funções celulares de holo-APP e seus C-terminfragmentos al. Mostrámos recentemente que AICD pode agregar in vitro, e este processo é inibido pelo ubiquilin-1-AD implicado chaperone molecular ^4. Consistente com estes resultados, a AICD expôs domínios hidrofóbicos e está intrinsecamente desordenados in vitro ^5,6, no entanto, obtém estrutura secundária estável quando ligado ao Fe65 ^7. Propusemos que ubiquilin-1 impede inadequado interacções inter-e intramolecular da AICD, prevenindo a agregação in vitro e em células intactas ^4. Enquanto a maioria dos estudos focado o papel de APP na patogénese de AD, o papel da AICD neste processo não são claras. Expressão da AICD foi mostrado para induzir a apoptose ^8, para modular as vias de sinalização ^9, e para regular a sinalização de cálcio ^10. A sobre-expressão da AICD e Fe65 num modelo de ratinho transgénico induz patologia de Alzheimer, como ^11, e recentemente AICD foi detectado no braem lisados ​​por western blotting quando usando técnicas de recuperação de antigénios apropriados ^12. Para facilitar os estudos estruturais, bioquímicas e biofísicas da AICD, desenvolvemos um procedimento para a produção de quantidades grandes de forma recombinante altamente pura proteína AICD. Iremos descrever um método para a indução in vitro da agregação térmica da AICD e análise por microscopia de força atómica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares na agregação AICD.

Protocolo

1. Expressão de domínio recombinante APP intracelular (AICD)

1. E. Transformação coli BL21 com AICD humana (resíduos 649-695 de APP, isoforma neuronal de numeração) clonado no vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector expressará AICD como a porção C-terminal de uma proteína de fusão de glutationa-S-transferase (GST). Este vector também codifica uma sequência de clivagem pela trombina para facilitar a remoção da porção GST. Detalhes da clonagem AICD em pGEX-4T-1 pode ser encontrada na nossa publicação anterior ^4.
2. A partir de uma colónia isolada, inocular 10 ml de caldo de LB com ampicilina (100 jig / ml) e incubar dur....

Discussão

Neste protocolo temos delineado um procedimento para obter AICD altamente puro para análises estruturais, biofísicos e bioquímicos. Este procedimento não requer equipamento sofisticado cromatografia e é, portanto, acessível para a maioria dos laboratórios. Outros grupos têm purificada AICD ^5-7,16, incluindo GST-AICD ^17-19, para as análises bioquímicas / estrutural. Desvantagens aos protocolos anteriores incluem fraca solubilidade do AICD ^16, menos do que ideal pureza ^17, e o r.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Bradford reagente de ensaio de proteínas	Bio-Rad	500-0002
Coomassie azul	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropil-beta-D tiogalactopiranósido)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutationa-agarose	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidina-agarose	Sigma-Aldrich	A7155
Cocktail inibidor de protease completo	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer cassetes de diálise	Thermo Scientific	66380
Colunas de cromatografia	Scientific Evergreen	208-3367-050
Emulsificante	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	Altamente recomendado
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Discos de mica	Ted Pella	50-12
Cantilevers de AFM	Bruker	MSNL-10
WSxM software	Nanotec	N / A	Free Download