Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Resumo

Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O recombinante E. coli E visualização de toxina se ligar a células eucarióticas vivo são descritos. Entrega localizada de toxina induz a mudanças rápidas e complexas em células-alvo, revelando novos aspectos da biologia toxina.

Resumo

Toxinas bacterianas ligar ao colesterol em membranas, formando poros que permitem o vazamento do conteúdo celular e influxo de materiais a partir do ambiente externo. A célula pode recuperar-se este insulto, o que requer processos de reparação activos de membrana, ou morrem, dependendo da quantidade de exposição a uma toxina e tipo de célula ^1. Além disso, estas toxinas induzir fortes respostas inflamatórias em hospedeiros infectados através da activação de células imunitárias, incluindo macrófagos, que produzem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias ^2. Muitas bactérias Gram-positivas produzem toxinas colesterol vinculativos que foram mostrados para contribuir para a sua virulência através de mecanismos largamente descaracterizados.

Alterações morfológicas na membrana plasmática das células expostas a estas toxinas incluem a sua sequestração em saliências colesterol enriquecidas de superfície, que podem ser derramadas para o espaço extracelular, sugerindo uma defesa celular intrínsecomecanismo de ^3,4. Este processo ocorre em todas as células na ausência de actividade metabólica, e pode ser visualizada usando EM após ⁴ a fixação química. Em células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, que medeiam a inflamação em resposta a exposição a uma toxina, vesículas de membrana induzidas são sugeridos para conter citocinas da família IL-1, e pode ser responsável tanto para o derramamento de toxinas e disseminação destas citoquinas pró-inflamatórias ^5,6,7. A ligação entre a IL-1β libertação e um tipo específico de morte celular, denominado pyroptosis tem sido sugerido, como ambos os processos são dependentes da caspase-1 ^8. Para resolver as complexidades desta resposta de macrófagos, que inclui a ligação da toxina, o derramamento de vesículas de membrana, a libertação de citoquinas, e da morte de células potencialmente, desenvolvemos técnicas de etiquetagem e de métodos de microscopia de fluorescência que permitem a visualização em tempo real da toxina de células-interacções, incluindo medidas de disfunção e morte (Figura 1). Usarde imagens de células vivas é necessária devido às limitações das outras técnicas. Abordagens bioquímicas não pode resolver os efeitos que ocorrem em células individuais, ao passo que a citometria de fluxo não oferece alta resolução, a visualização em tempo real das células individuais. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados a análise cinética de respostas induzidas por estímulos que envolvem complexos alterações fenotípicas em células.

Protocolo

1. Purificação de Estreptolisina O (SLO)

1. Inocular 20 mL de cultura durante a noite de células BL21 contendo ouro pBADgIII-SLOhis plasmídeo ⁹ em 0,5 L de caldo LB e adicionar 500 ul de 50 mg / ml de ampicilina. Agitar a cultura a 225 rpm a 37 ° C até _DO600 = 0,6, geralmente ~ 1,5 horas. Centrifugar 1 ml (bactérias consideradas T ₀₎ a 10.000 xg 5 min, dissolver o granulado em 140 ul de tampão de amostra SDS 1x / 1 OD e sonicar a DNA de cisalhamento para análise de pureza da proteína.
2. Induzir bactérias, com a adição de 5 ml de 20% de arabinose a cultura, agitar a 225 rpm à temperatura ambiente durante 3 hr. Colete 1 ....

Resultados

Tipicamente 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO pode ser obtida com uma concentração de proteína de 4 mg / ml. A quantidade de toxina necessária para a lise das células varia com o tipo de célula, mas é geralmente 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células, como os macrófagos podem ser mais resistentes (4000 U / ml), embora outras linhas de células (especialmente T) são mais sensíveis. Estas sensibilidades corresponder com SLO comercialmente disponível. A actividade da toxina diminui cerca.......

Discussão

As técnicas descritas aqui permitem a análise das respostas de células imunes para as toxinas bacterianas. A etapa mais crítica é o manuseamento e a dosagem da toxina. A actividade da toxina pode ser extremamente variável, mesmo entre diferentes alíquotas da mesma preparação, devido à sua fragilidade. Isto requer tanto o teste de cada aliquota de toxina contra uma linha de células de referência, ou RBCs ou utilizando gradientes de toxina. Gradientes de toxina, tal como entregue por micropipeta, permitir que o espectro t.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polimixina-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba dessalinizar rotação col	Pescador	PI-89891
hemácias de ovinos	Pescador	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	ver ref 9
Cy5 corante monoreactive	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calceína AM / Ethidium homodímero	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
colágeno revestido prato fundo de vidro	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-ponta II	Pescador	E5242957000
Microloader	Pescador	E5242956003
dextrano Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Lista Tabela 1. Ea fonte de reagentes específicos e Equipent necessário. Equipamentos específicos e reagentes utilizados neste protocolo, juntamente com a empresa e número de catálogo estão listados.
			Tampão Composição Passo Usado Lyse / Wash 50 mM de NaH 2 PO 4 300 mM de NaCl Imidazole 10 mM, pH 8,0 1,4 Tris / sal 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl 1,7 Tampão de eluição 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole 250 mM 1,8 O tampão de ensaio RBC 0,3% de BSA 2 mM de CaCl 2 HEPES 10 mM, pH 7,4 2,1 tampão R / B Meio de cultura RPMI célula 2 mM de CaCl 2 BSA a 0,5% 3,1
			Lista Tabela 2. Dos buffers usados ​​neste protocolo. Os tampões utilizados, a sua composição e a primeira etapa em que são usados ​​no protocolo estão listadas.