Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Summary

Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O recombinante E. coli E visualização de toxina se ligar a células eucarióticas vivo são descritos. Entrega localizada de toxina induz a mudanças rápidas e complexas em células-alvo, revelando novos aspectos da biologia toxina.

Abstract

Toxinas bacterianas ligar ao colesterol em membranas, formando poros que permitem o vazamento do conteúdo celular e influxo de materiais a partir do ambiente externo. A célula pode recuperar-se este insulto, o que requer processos de reparação activos de membrana, ou morrem, dependendo da quantidade de exposição a uma toxina e tipo de célula ^1. Além disso, estas toxinas induzir fortes respostas inflamatórias em hospedeiros infectados através da activação de células imunitárias, incluindo macrófagos, que produzem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias ^2. Muitas bactérias Gram-positivas produzem toxinas colesterol vinculativos que foram mostrados para contribuir para a sua virulência através de mecanismos largamente descaracterizados.

Alterações morfológicas na membrana plasmática das células expostas a estas toxinas incluem a sua sequestração em saliências colesterol enriquecidas de superfície, que podem ser derramadas para o espaço extracelular, sugerindo uma defesa celular intrínsecomecanismo de ^3,4. Este processo ocorre em todas as células na ausência de actividade metabólica, e pode ser visualizada usando EM após ⁴ a fixação química. Em células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, que medeiam a inflamação em resposta a exposição a uma toxina, vesículas de membrana induzidas são sugeridos para conter citocinas da família IL-1, e pode ser responsável tanto para o derramamento de toxinas e disseminação destas citoquinas pró-inflamatórias ^5,6,7. A ligação entre a IL-1β libertação e um tipo específico de morte celular, denominado pyroptosis tem sido sugerido, como ambos os processos são dependentes da caspase-1 ^8. Para resolver as complexidades desta resposta de macrófagos, que inclui a ligação da toxina, o derramamento de vesículas de membrana, a libertação de citoquinas, e da morte de células potencialmente, desenvolvemos técnicas de etiquetagem e de métodos de microscopia de fluorescência que permitem a visualização em tempo real da toxina de células-interacções, incluindo medidas de disfunção e morte (Figura 1). Usarde imagens de células vivas é necessária devido às limitações das outras técnicas. Abordagens bioquímicas não pode resolver os efeitos que ocorrem em células individuais, ao passo que a citometria de fluxo não oferece alta resolução, a visualização em tempo real das células individuais. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados a análise cinética de respostas induzidas por estímulos que envolvem complexos alterações fenotípicas em células.

Protocol

1. Purificação de Estreptolisina O (SLO)

1. Inocular 20 mL de cultura durante a noite de células BL21 contendo ouro pBADgIII-SLOhis plasmídeo ⁹ em 0,5 L de caldo LB e adicionar 500 ul de 50 mg / ml de ampicilina. Agitar a cultura a 225 rpm a 37 ° C até _DO600 = 0,6, geralmente ~ 1,5 horas. Centrifugar 1 ml (bactérias consideradas T ₀₎ a 10.000 xg 5 min, dissolver o granulado em 140 ul de tampão de amostra SDS 1x / 1 OD e sonicar a DNA de cisalhamento para análise de pureza da proteína.
2. Induzir bactérias, com a adição de 5 ml de 20% de arabinose a cultura, agitar a 225 rpm à temperatura ambiente durante 3 hr. Colete 1 ml de cultura bacteriana, centrifugar e dissolver em 1x tampão de amostra de SDS como acima para T de tempo ₃ para análise de pureza.
3. Recolher as bactérias remanescentes no frasco de 500 ml de centrífuga, girar 12000 xg durante 12 min a 4 ° C (8.500 rpm rotor Sorvall GS-3). Decantar o sobrenadante, armazenar pelete a -80 ° C durante a noite ou mais tempo, se necessário.
4. Ressuspender o frozen pellet em gelo em 10 ml de Lise / O tampão de lavagem (50 mM de NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM de imidazole, pH 8,0) suplementado com 400 ul de 25% de Triton X-100, 100 uL de 100 mg / ml de lisozima, 50 200 ul mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Transferir o sedimento ressuspenso para tubo de 50 ml de Ridge Oak.
5. Sonicar lisado 5 vezes durante 30 segundos em gelo, com intervalos de 30 seg. Spin-lisado sonicado em carvalho cume tubo a 39.000 xg durante 20 min a 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor).
6. Enquanto o lisado está girando, lave 1 ml de Ni-NTA agarose com 10 ml de Lise / tampão de lavagem e centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. (Todas as lavagens adicionais / eluições utilizar a centrifugação sob estas condições). Aspirar lavar.
7. Adicionar sobrenadante bacteriano a partir do passo 1.5 a Ni-NTA agarose, agitar durante 2,5 horas a 4 ° C. Gire para recolher o sobrenadante. Combine 30 ul de sobrenadante com 10 tampão de amostra μ 4x SDS e salvar para análise de pureza. Lavar as pérolas 4 vezes em Lyse / tampão de lavagem e emce em Tris / sal tampão (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluir 3 vezes por adição de 1 ml de tampão de eluição (250 mM de imidazole em Tris / tampão salino) e 5 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT) a grânulos, incubação em gelo durante 10 min, centrifugação e recolhendo o sobrenadante. SLO é uma proteína muito sensível redox, e devem ser mantidos em gelo em todos os momentos. Uma vez reduzida, a proteína perderá rapidamente a sua actividade, se aquecido a 37 ° C, mesmo durante um curto período de tempo.
9. Lave 500 ul polimixina-conjugado de agarose em tampão de eluição, rotação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul. Para esgotar endotoxina, adicionar 200 ul de contas de cada eluição e agitar 4 ° C durante 30 min. Centrifugação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C, e guardar o sobrenadante. Combinar 30 ul de cada um de eluição com tampão de amostra de 10 ul 4x SDS para SDS-PAGE análise.
10. Testar a pureza de eluições por SDS-PAGE. Ferver as amostras guardadas para análise em gel a 95 ° C durante 5 min e 10 ul de carga sobre um gel a 10%. Mancha gel com Coomassie para visualizar proteína (Figura 2A). SLO é de 69 kDa. Executar um ensaio de Bradford para a determinação da concentração de proteína (rendimento típico é de 4 mg / ml para os primeiros dois eluições, mas pode variar de acordo com estirpe bacteriana e do plasmídeo utilizado).
11. Testar a actividade hemolítica de cada eluição (ver abaixo). Eluições piscina onde a atividade de concentração, pureza e hemolítica são satisfatórios. SLO alíquota em alíquotas de utilização única (ul tipicamente 5-10), em gelo seco congelar e armazenar a -80 ° C.

2. Ensaio hemolítico

1. Lavar glóbulos vermelhos de ovelha (RBC) em RBC tampão de ensaio (0,3% de albumina de soro bovino (BSA), 2 mM _de CaCl2, 10 mM de Hepes, pH 7,4), centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min, e ressuspender em 2,5% em RBCs 10 ml de tampão de ensaio RBC.
2. Adicionar 10 ul de tampão de ensaio RBC / poço em placas de 96 poços de fundo em V de gelo. Série diluir cada eluição em duplicata. Gamas de diluição típicos são de 1:1.000 1:512,000. Incluem 3 poços sem toxina e 3 com 10 poçosul de Triton X-2% 100 como poços mínimo e máximo, respectivamente.
3. Cobrir a placa e incubar a 37 ° C 30 min. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 min. Transferir 70 uL de sobrenadante para uma placa de fundo plano de 96 poços. Leia A _405. Uma unidade é a diluição da toxina necessária para a lise de 50% dos glóbulos vermelhos. Atividade toxina é uma unidade * diluição factor/0.01 ml.

3. Ensaio de célula Lytic

1. Células de colheita, a contagem, spin. Ressuspender a 2x10 ⁶ / ml em tampão de R / B (RPMI com CaCl2 ₂ mM, BSA 0,5%) e 20 ug / ml de iodeto de propídio. Adicionar 100 ul de células de uma placa de 96 poços de fundo em V.
2. Seriadamente diluído SLO para 2x a concentração final em tampão de R / B, adicionar 100 ul de toxina ou 100 ul de tampão P / B às células. Incubar 5 min a 37 ° C. Gama típica de concentrações finais de 2,000 U / ml para 31,25 U / mL.
3. Executar células em citômetro de fluxo e recolher dados com filtros de ficoeritrina (PE). Uma mudança de um log-cel representa transitoriamente permeabilizadasls, enquanto um desvio de log 3 indica as células mortas ^4. Calcula-se a lise específica de células, subtraindo a percentagem de células mortas no controlo (% PI ^elevado _ctl) a partir da _(exp% PI ^elevado) experimental, como se segue: a lise específica = (% _exp PI ^elevado -% PI ^elevado _ctl) / (100 -% PI ^elevado _ctl) * 100

4. Micropipeta Entrega de Toxina de células em placas de cultura

1. Um dia antes da experiência, placa 2x10 ⁵ macrófagos em um colágeno revestido prato milímetros com fundo de vidro-35.
2. Ligue microscópio e microinjetor. Permitir tempo fase aquecida a aquecer até 37 ° C. A escolha do microscópio geralmente depende do que está localmente disponível. O microscópio de fase invertida precisa de uma, uma fase capaz de aquecer os pratos a 37 ° C, os cubos de excitação / emissão de filtro apropriadas para o corante escolhido, e o espaço de ligar fisicamente o microinjector. Uma lente Bertrandé útil para a micro-injecção, mas não exigida. O computador dirigir o microscópio precisa de memória suficiente para coletar e armazenar dados.
3. Células do rótulo para 30 min com corante, a 37 ° C. Dependendo do ensaio, etiquetagem pode ser feita com 5 uL Fura2 AM em 1 ml de PBS ou 2 ul de calceína AM em 1 ml de meio completo. Para Fura2, excitação / emissão é recolhida para 340/510 nm e 380/510 nm e a razão de 340/380 determina os sinais de fluxo de cálcio. Para calceína, excitação / emissão é 495/515 nm, enquanto etídio homodímero é 525/620 nm e APC é 650/660 nm. Outros rótulos podem ser escolhidos também.
4. Lavar as células com PBS e colocar em 1 ml de RPMI suplementado com 2 mM de CaCl _2. Montar em microscópio.
5. Diluir a toxina e o dextrano em água e centrifugar a 20000 xg durante 10 min 4 ° C. Tipicamente, uma SLO ul e 4 uL de 10 mg / ml de dextrano-555 é diluído em 6 ul de água. Dextrano ou outra molécula de fase fluida fluorescente é usado para verificar que o femto-ponta não estiver obstruído, e injects, como desejado.
6. Carregar femto ponta da parte traseira com 0,07 ul de toxina diluída utilizando uma microloader.
7. Carregar femto-ponta na microinjetor. Ajustar o ângulo do injector de modo a que a ponta se sentar sobre o centro das células, com espaço para se mover em todas as direções. Limpar z-limite. Configurações de injeção deve ser para injetar 0,5 segundos a 120 psi com pressão de 20 psi de volta. Diminuir ponta até que entra no meio.
8. Usando a lente Bertrand, centro da ponta e seguem a ponta, uma vez que é reduzida mais perto das células. Depois de perder o foco, voltar a ótica normais. A sombra da agulha deve ser aparente no campo. Concentre-se as células acima e abaixe a agulha até que esteja em foco. Concentre-se novamente as células e cuidadosamente trazer a agulha adjacente a uma célula. Definir o z-limite para a injeção. Iniciar imaging, mover a ponta para a posição desejada, injectar a libertar a toxina no ponto de tempo desejado. Levante a agulha, passar para uma nova região de células e injectar. Mover agulha para a posição inicial para evitar indesejadavazamento toxina da agulha.

Results

Tipicamente 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO pode ser obtida com uma concentração de proteína de 4 mg / ml. A quantidade de toxina necessária para a lise das células varia com o tipo de célula, mas é geralmente 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células, como os macrófagos podem ser mais resistentes (4000 U / ml), embora outras linhas de células (especialmente T) são mais sensíveis. Estas sensibilidades corresponder com SLO comercialmente disponível. A actividade da toxina diminui cerca...

Discussion

As técnicas descritas aqui permitem a análise das respostas de células imunes para as toxinas bacterianas. A etapa mais crítica é o manuseamento e a dosagem da toxina. A actividade da toxina pode ser extremamente variável, mesmo entre diferentes alíquotas da mesma preparação, devido à sua fragilidade. Isto requer tanto o teste de cada aliquota de toxina contra uma linha de células de referência, ou RBCs ou utilizando gradientes de toxina. Gradientes de toxina, tal como entregue por micropipeta, permitir que o espectro t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polimixina-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba dessalinizar rotação col	Pescador	PI-89891
hemácias de ovinos	Pescador	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	ver ref 9
Cy5 corante monoreactive	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calceína AM / Ethidium homodímero	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
colágeno revestido prato fundo de vidro	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-ponta II	Pescador	E5242957000
Microloader	Pescador	E5242956003
dextrano Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Lista Tabela 1. Ea fonte de reagentes específicos e Equipent necessário. Equipamentos específicos e reagentes utilizados neste protocolo, juntamente com a empresa e número de catálogo estão listados.
			Tampão Composição Passo Usado Lyse / Wash 50 mM de NaH 2 PO 4 300 mM de NaCl Imidazole 10 mM, pH 8,0 1,4 Tris / sal 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl 1,7 Tampão de eluição 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole 250 mM 1,8 O tampão de ensaio RBC 0,3% de BSA 2 mM de CaCl 2 HEPES 10 mM, pH 7,4 2,1 tampão R / B Meio de cultura RPMI célula 2 mM de CaCl 2 BSA a 0,5% 3,1
			Lista Tabela 2. Dos buffers usados ​​neste protocolo. Os tampões utilizados, a sua composição e a primeira etapa em que são usados ​​no protocolo estão listadas.