A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.
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Artigo de método
A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cartilagem articular sofre de uma capacidade limitada de reparação quando danificadas por insulto mecânico ou degradada pela doença, tais como a osteoartrite. Para sanar esta deficiência, várias intervenções médicas têm sido desenvolvidos. Um tal método é a ressurgir a área danificada com o tecido de cartilagem artificial, no entanto, a engenharia de tecidos tipicamente não tem as propriedades bioquímicas e durabilidade da cartilagem nativa, questionar a sua sobrevivência a longo prazo. Isto limita a aplicação de engenharia de tecidos de cartilagem para a reparação de pequenos defeitos focais, baseando-se o tecido circundante para proteger o material implantado. Para melhorar as propriedades do tecido desenvolvido, estimulação mecânica é um método popular utilizado para aumentar a síntese de matriz extracelular cartilaginosa, assim como as propriedades mecânicas dos resultantes da engenharia de tecidos. Estimulação mecânica aplica forças ao tecido constrói análoga àquelas experimentadas in vivo. Estebaseia-se na premissa de que o ambiente mecânico, em parte, regula o desenvolvimento e manutenção de 1,2 tecido nativo. A forma mais vulgarmente aplicado de estimulação mecânica na engenharia de tecidos de cartilagem é de compressão dinâmica em estirpes fisiológicas de aproximadamente 5-20%, com uma frequência de 1 Hz 1,3. Vários estudos investigaram os efeitos de compressão dinâmica e têm mostrado que para ter um efeito positivo sobre o metabolismo dos condrócitos e a biossíntese, em última análise afectar as propriedades funcionais do tecido desenvolvido 4-8. Neste artigo, vamos ilustrar o método para estimular mecanicamente construções condrócitos-agarose hidrogel sob compressão dinâmica e analisar as alterações na biossíntese através de testes bioquímicos e radioisótopo. Este método também pode ser facilmente modificado para avaliar as alterações potencialmente induzidos em resposta celular, como resultado de estímulos mecânicos.
Protocolo
1. Isolamento de condrócitos articulares primárias
Colheita 10-15 fatias de cartilagem de espessura completa das superfícies articulares das articulações de animais (por exemplo, a articulação metacarpo-falângica de vacas com esqueleto maduro obtido a partir de um matadouro local).
- Coloque fatias de cartilagem em uma placa de Petri de 100 mm e Incubar em 20 ml de 0,5% de protease em Ham F-12 (w / v) durante 2 horas a 37 ° C. Enxaguar três vezes em meio de Ham F-12 de cultura, e incuba-se com 20 ml de colagenase a 0,15% em meio A de Ham F-12 de cultura durante a noite a 37 ° C.
- Filtra-se a suspensão de células através de um filtro de tela de 200 mesh para uma placa limpa. Lavar o filtro com 5 ml de Ham F-12 e adicionar ao prato. Transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 50 ml. Lava-se a placa de Petri com 10 mL de Ham F-12 e adicionar ao tubo cónico.
- Centrifugar o tubo de 600-800 rcf durante 6-8 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante, garantindo a não perturbar the sedimento de células e re-suspensão em 40 ml de meio de Ham F-12 de cultura.
- Centrifugar o tubo de 600-800 rcf durante 6-8 min.
- Repita os passos 1.4 e 1.5 vezes mais para um total de 3 vezes. Antes da centrifugação, pela terceira vez, ressuspender o sedimento através da agitação e da obtenção de uma alíquota de 500 ul para a contagem de células.
- Contar as células viáveis utilizando o método de exclusão de azul de Tripan 9 com um hemacitómetro e um microscópio óptico invertido.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um volume de F-12 de Ham meios para dobrar a densidade de sementeira desejada (por exemplo, 20 x 10 6 células / ml, para uma concentração final de 10 x 10 6 células / ml, após o encapsulamento).
2. Condrócitos-agarose Encapsulation Hydrogel
- Aquecer 0,8 g Tipo VII autoclavado agarose em 20 ml de solução estéril 1x PBS (pH 7,4) numa placa quente a 120 ° C até à dissolução. Uma vez dissolvido, reduzir o calor a 60 ° C como temperaturas mais elevadas will afetar a viabilidade celular.
- Num tubo cónico de 50 ml, misturar cuidadosamente volumes iguais da suspensão de células com o dobro da concentração desejada de agarose (por exemplo, 4% de suspensão de agarose para um final de hidrogel de agarose 2%). Evitar a criação de bolhas grandes, pois podem afectar a viabilidade celular e construir a resistência à fadiga.
- Cuidadosamente uma alíquota de 10 ml da mistura de condrócitos-agarose em um prato de 60 milímetros de diâmetro Petri, evitando a criação de bolhas grandes.
- Deixar repousar durante 30 min à temperatura ambiente até que gelificou.
- Obter o maior número de amostras de hidrogel de agarose-condrócito conforme necessário (tipicamente 20-30) utilizando um perfurador de biópsia 4 milímetros.
- Medir e registrar as dimensões físicas (diâmetro e altura) de amostras representativas, utilizando um micrômetro. Construtos deve ser aproximadamente de 5 mm de altura, descartar quaisquer amostras obtidas a partir de uma região na qual a variação de altura da amostra foi superior a 2%.
- Transferir as amostras para um prato 60 milímetros fresco Petri e suplementocom 10 ml de meio completo (por exemplo, 20% de soro fetal bovino em meio de Ham F-12 de cultura com 20 mM de HEPES, 100 mg de ácido ascórbico / ml, e antibióticos / antimicóticos 2x).
3. A estimulação mecânica e marcação radioactiva de condrócitos-agarose Hidrogéis
- Autoclavar os componentes metálicos do equipamento de compressão. Esterilizar os componentes de plástico com 70% de etanol (durante a noite) e luz ultravioleta (por, pelo menos, 15 min).
- Para manter as construções de cair, utilizando fórceps, o local 12 anéis de plástico estéreis de retenção (com um diâmetro interior maior do que o diâmetro do construto) (n = 6, as amostras e controlos), dentro dos poços de uma placa de cultura de 24 cavidades.
- Usando fórceps, transferir cuidadosamente os hidrogéis de condrócitos-agarose a partir de uma placa de Petri para a placa de 24 poços, assegurando cada uma em um anel de retenção.
- Transferir 400 uL de meio completo (por exemplo, 20% de FBS em meio de Ham F-12 de cultura com 20 mM de HEPES, 100 ug / ml de ácido ascórbico, e2x antibiótico / antimicótico) a cada poço de amostra.
- Monte o equipamento de compressão esterilizada (Figura 1) e fixe as placas com parafusos. Anexar o equipamento de compressão na placa de cultura de 24 cavidades.
- Solte e re-assegurar os parafusos de ajuste para estabelecer cilindro hidrogel contato (zero estado de tensão).
- Carregar o equipamento de compressão montados em um sistema de testes de Mach-1 micromecânico. Plataforma segura para a fase vertical via pino de localização e bloqueio no local com parafuso de fixação. Remova o gabarito de espaçamento.
- Aplicar carga de compressão dinâmica da amplitude desejada (por exemplo, amplitude de deformação de 10% com base na altura original das amostras), a frequência (por exemplo, 1 Hz) e duração ou quantidade de ciclos (por exemplo, intervalos de tempo de até 60 min.)
- Após a conclusão da estimulação mecânica, substituir o dispositivo de montagem de espaçamento, soltar o parafuso de fixação do pino de localização e remover o equipamento de compressão e a partir da placa de cultura de Teste do Sistema de Mach-1 micromecânico.
- Radiomarcador célula-hidrogel construções, completando os meios de comunicação com 5 uCi de isótopo desejado (por exemplo, [3 H]-prolina etiqueta proteína por condrócitos específicos de síntese de colagénio e [35S]-enxofre para a síntese de proteoglicanos).
- Incubar as construções marcadas radioactivamente, durante 24 horas a 37 ° C, 5% CO 2, 10.
- Colheita das construções de hidrogel radiomarcados e lavar 3 vezes em 1x PBS (pH 7,4) para remover qualquer isótopo não incorporado. Digest amostras utilizando papaína (40 ug / ml em acetato de amónio 20 mM, 1 mM de ácido ethyldiaminetetraacetic e 2 mM de ditiotreitol a 65 ° C durante 72 horas).
- Ensaio de digest para o conteúdo de ADN, utilizando o ensaio de PicoGreen corante 11 e incorporou actividade isótopo, normalizados para o conteúdo de ADN, por β-líquido de cintilação de contagem 12,13 digestão com papaína imediatamente a seguir.
Nota: A compra e descarte de materiais radioativos (isótopos de resíduos e itensque possam ter estado em contacto materiais radioativos) devem seguir o institucional relevante (e / ou governamentais) políticas e procedimentos para o manuseio e eliminação de substâncias radioactivas.
4. Resultados representativos
Bovina articulares construções condrócitos-agarose hidrogéis (2% de agarose com 10 x 10 6 células / ml, as células encapsuladas) foram estimulados mecanicamente a uma amplitude de 10% de deformação à compressão a uma frequência de 1 Hz por 20 a 60 minutos (ou 1200 a 3600 ciclos ) e ensaiadas para teor de ADN e síntese de matriz extracelular, por incorporação de radioisótopos. DNA e síntese de matriz extracelular foi afetado de maneira dose-dependente. O conteúdo de DNA apresentaram uma redução significativa de 35% como resultado de 20 ou 30 minutos de estimulação (p <0,01), enquanto 60 minutos de estimulação não exibiu qualquer efeito (Figura 2). Cartilagem específica a síntese do colagénio e proteoglicanos (determinado por [3H]-prolina e[35S]-incorporação de enxofre, respectivamente) exibiram aumentos significativos de cerca de 60% em resposta a 20 ou 30 minutos de estimulação (p <0,01), com 60 minutos de estimulação que não apresente efeito observável (Figura 3).
. Figura 1 Esquema do equipamento de compactação de custom-built dinâmica para estimular condrócitos-agarose construções esquerda:. Plataforma Montada direita:. Vista explodida mostrando componentes individuais.
Figura 2. Alterações no conteúdo de ADN de condrócitos-agarose hidrogéis estimulada mecanicamente sob uma amplitude de deformação de compressão a 10% a 1 Hz durante 20 a 60 min (média ± SEM, n = 6/grupo).
Figura 3. Alterações na síntese da matriz extracelular (colagénio e proteoglicanos) de condrócito-agarose hidrogéis mecanicamente estimulados sob amplitude de deformação à compressão a 10% a 1 Hz durante 20 a 60 min (média ± SEM, n = 6/grupo).
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Discussão
O método descrito para a aplicação de estímulos mecânicos controlados de hidrogéis de agarose de células-seeded permite a investigação directa sobre os efeitos de forças de compressão dinâmica sobre o metabolismo dos condrócitos. A utilização do equipamento de teste de costume em conjunto com os anéis de retenção fornecido restrição lateral para as construções, para evitar potenciais problemas de amostra de inflexão. O uso de placas mortos ponderados carregamento garantidos pelas tripulações conjuntos garante o co...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente ou do equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Ham F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| A colagenase | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Soro Fetal Bovino | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbato | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibióticos / antimicóticos | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan azul | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Brilhante-Line Hemocitômetro | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papaína a partir do látex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Acetato de amónio | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ácido Ethyldiaminetetraacetic | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Ditiotreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Baixo ponto de fusão de agarose, Tipo VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Tela de malha (200) Filtrar | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Tester micromecânico | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Carregando compressão Jig | Custom-built | Produto similar pode ser fornecida por Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Placa Cultura Bem | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] prolina | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Enxofre | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Referências
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Reimpressões e permissões
