Imagem não invasivo de rejeição do enxerto aguda após Rat Transplante Renal Usando<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

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Artigo de método

Imagem não invasivo de rejeição do enxerto aguda após Rat Transplante Renal Usando

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DOI:

10.3791/4240

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28 de abril de 2013

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um modelo de transplante renal de ratos para não-invasiva avaliar a rejeição do enxerto aguda usando tomografia por emissão de pósitrons com 18F-fluorodeoxyglucose.

Resumo

O número de pacientes com doença renal em estágio final, eo número de pacientes transplantados renais aumenta continuamente. Episódios de rejeição do enxerto celular aguda (AR) são um fator prognóstico negativo para a sobrevivência do enxerto a longo prazo, e seu diagnóstico atempado é fundamental para a função do enxerto ^1. No momento, AR só pode ser definitivamente diagnosticada por biópsia por agulha, que, como um método invasivo, descobre risco significativo de lesões ou até mesmo a perda do enxerto. Além disso, as biópsias não são viáveis em pacientes que tomam medicamentos anticoagulantes e no site amostragem limitada desta técnica pode resultar em resultados falso-negativos se a AR é focal ou irregular. Como consequência, isto deu origem a uma busca permanente de novos métodos de detecção de AR, o que muitas vezes tem de ser feito em animais, incluindo a utilização de vários modelos de transplante.

Desde o início dos anos 60 rato transplante renal é um método experimental bem estabelecido para o exação e análise de AR ^2. Nós aqui presente, além de pequenos animais tomografia por emissão de pósitrons (PET), utilizando ¹⁸ F-(FDG) para avaliar a AR em um modelo alogênico uninefrectomizados rato transplante renal e propor enxerto imagem FDG-PET como uma nova opção para a não-invasivo, específico e diagnóstico precoce de AR também para a situação humana ^3. Além disso, este método pode ser aplicado para o follow-up para melhorar o monitoramento da rejeição do transplante ^4.

Protocolo

1. Recuperação Organ Donor

Configure o microscópio estereotáxica, peso registro da 8-10 semanas de idade rat (doador e receptor de peso corporal deve corresponder).
Anestesiar o rato doador (Lewis Brown Noruega F1, LBN F1) usando oxigênio / inalação de isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min de oxigênio). Manutenção da anestesia através da redução de 2-2,5% de isoflurano.
Colocar o rato anestesiado no bloco operatório. Fix extremidades do rato com fita adesiva sobre o bloco e aplicar pomada oftálmica (Bepanthen, Bayer) para os olhos do rato.
Barbear e desinfectar o abdómen do rato e de uma incisão na linha mediana ventral a partir do púbis para a borda caudal do fígado. Expor o rim esquerdo e seus navios movendo cuidadosamente o intestino para o lado direito. Depositar uma fina folha de gaze sobre o rim esquerdo e humedecer com solução salina isotônica aquecido para evitar a dessecação.
Dissecar cuidadosamente o tecido adiposo com Dumont Pinça ponta angular (SS-Dumont45 Pinça Inox Medical, Ferramentas Ciência Fine, Cat.No. 11203-25) que envolve o uréter esquerdo. Evite qualquer contato direto com o ureter, em vez disso, mobilizá-lo com suficiente circundante tecido adiposo.
Separe a veia renal esquerda da artéria renal Dumont usando uma pinça ponta angular. Remova toda a gordura e tecido conjuntivo de ambos os navios e cauterizar os vasos renais e testicular.
Dissecar aorta ea veia cava inferior (IVC), acima e abaixo da sua junção com a artéria e veia renal esquerda, respectivamente, e todas as artérias cauterizar saída.
Braçadeira supra-renal da aorta com uma braçadeira microcirúrgico (Micro Serrefines, ferramentas finas Science, N ° de Cat. 18055-04) acima da artéria renal esquerda, tão próximo quanto possível da artéria mesentérica superior. Ligadura aorta infrarenal utilizando seda cirúrgico (5-0, Vömel, nenhuma arte. 14739) a cerca de 5 mm abaixo da artéria renal esquerda.
Ligadura da VCI infra-renal com seda cirúrgica (5-0, Vömel), e prenda a VCI supra-renalcom uma pinça de microcirurgia (Micro Serrefines, Ferramentas Ciência Fine, Cat.No. 18.055-03).
Corte a veia renal tão perto quanto possível do IVC com uma tesoura fina (Iris Scissors - ToughCut reta 11,5 centímetros, Ferramentas Ciência Fine, Cat.No. 14.058-11).
Lentamente perfundir o rim in situ com solução de perfusão 2 ml gelada HTK (Custodiol HTK, Dr. Franz Köhler Chemie) inserindo uma cânula (Microlance 3 27G ¾, BD, Ref. ª 302200) na aorta infra-renal. Confirmar que as mudanças de cor renais (agora oliva cor).
Em primeiro lugar, cortar através de supra-renal da aorta, em seguida, a aorta infra-renal e, finalmente, o ureter tão próximo quanto possível da bexiga urinária.
Remover o rim e o seu fornecimento vascular juntamente com o ureter e armazenar em solução de perfusão HTK em gelo.
Eutanásia o rato dador por remoção dos grampos vasculares e excisão consecutivo do coração sob anestesia.

2. Preparação destinatário e transplanteção

Configure o microscópio estereotáxica, peso registro do rato.
Anestesiar o rato destinatário (Lewis) utilizando isoflurano 4%. Manutenção da anestesia através da redução de 2-2,5% de isoflurano.
Colocar o rato anestesiado no bloco operatório. Fix extremidades do rato com fita adesiva sobre o bloco e aplicar pomada oftálmica para os olhos do rato `s. Monitor e controlo da temperatura do corpo do núcleo utilizando um sensor de temperatura rectal e uma almofada de aquecimento. Durante a cirurgia repetitivamente controlar a temperatura, a respiração e a frequência cardíaca dos animais.
Barbear e desinfectar o abdómen e uma incisão na linha mediana ventral a partir do púbis para a borda caudal do fígado. Usar um bisturi forcutting a pele, a fim de minimizar o trauma da pele. Expor o rim esquerdo e seus vasos movendo o intestino para o lado direito.
Remova cuidadosamente a cápsula renal usando uma pinça Dumont ponta angular e cotonetes.
Ocluir o lado esquerdo da artéria renal, veia e perto do ureter renalhilo com duas ligaduras usando fio cirúrgico (Mersilene 4-0, Ethicon, cat. nenhum. EH6732H). Impostos a maior parte do rim, deixando apenas o hilo renal. Limpe a superfície de corte com cotonetes e verificar se há sangramento. Adicionar outra ligadura se necessário.
Dissecar cuidadosamente sem rodeios através do tecido conjuntivo que cobre a aorta infra-renal e veia cava no site caudal com cotonetes.
Separar qualquer nervo visível a partir da aorta infra-renal e veia cava Dumont usando uma pinça ponta angular.
Dissecar cuidadosamente através da folha de tecido conjuntivo entre a aorta infra-renal e veia cava inferior, formando duas aberturas de 2-4 mm de comprimento: O primeiro abaixo da ramificação dos vasos testiculares, e a segunda uma acima da ramificação dos vasos ilíacos comuns. Iliolombar cauterizar as artérias e veias no meio.
Desenhe um único fio cirúrgico (Mersilene 0;. Ethicon, gato no.EH6665E) por cada uma das duas aberturas. Usando esses tópicos puxar a infra-aorta e veia cava suavemente para o lado direito do animal para ter acesso aos vasos ramificados no local dorsal. Cauterize qualquer destes navios entre as duas aberturas e remover os fios cirúrgicos posteriormente.
Em seguida, ocluir aorta e veia cava inferior através da aplicação dos ponteiros do relógio de quatro grampos microcirúrgicos (Micro Serrefines, ferramentas finas Science, N ° de Cat. 18055-04), com início na abertura superior com a aorta e terminando com a veia cava superior, na abertura (Micro Serrefines , Belas Tools ciência, Cat.No. 18.055-03).
Depois cuidadosamente furar o final superior da parte isolada da aorta com uma agulha (Microlance 3 27G ¾, BD, Ref. ª 302200), insira a lâmina inferior de uma tesoura de primavera (Vannas Primavera Scissors - 3 mm Lâminas, Fine Ciência Ferramentas, cat.no 15000-00), através da abertura de furos e realizar uma incisão longitudinal curto. Lave a aorta isolada com solução de perfusão HTK-gelada para remover qualquer vestígio de sangue restante.
Da mesma forma, cuidadosamente perfurantea parte inferior da parte final isolado da veia cava com uma agulha, inserir a lâmina inferior de uma mola de tesoura fina, através da abertura de punção e uma incisão longitudinal, terminando pouco abaixo da incisão da aorta. Mais uma vez, lave o navio para remover qualquer vestígio de sangue restante.
Remover o enxerto de rim a partir da solução de armazenamento. Coloque-o abaixo da posição anterior do rim esquerdo, e garantir que ele está na direção correta.
Verifique a orientação da artéria renal enxertos e garantir que não haja torções. Em seguida, coloque uma folha fina de gaze sobre o enxerto e umedecê-la com a solução de perfusão HTK gelada para resfriá-lo e evitar a dessecação.
Fixar a abertura da parte da supra-renal da aorta pedaço em que a artéria renal do enxerto se abre para com fio cirúrgico (9-0 Ethilon, Ethicon, o gato já 2809G..) - Em primeiro lugar no lado superior, em seguida, na extremidade inferior de a incisão da aorta. Fechar a incisão no sentido horário, com uma sutura contínua, usando fio cirúrgicoEthilon (9-0), Dumont fórceps ponta angular e um suporte de agulha Castroviejo curvo (Ferramentas Ciência Fine, cat. Nenhum. 12.061-01). Em seguida, cobrir a primeira sutura com tecido conjuntivo através de uma segunda sutura contínua anti-horário. Agora, apenas a parte inferior da peça de aorta do enxerto continua a ser fechado. Regularmente resfriar o enxerto com solução de perfusão HTK gelada.
Perfundir o enxerto com 1 ml de solução de perfusão HTK gelada através de uma agulha romba inserido na extremidade aberta da peça de aorta enxertos validar a integridade do aperto e da sutura, bem como a remoção do sangue remanescente no enxerto. Depois, ligadura da extremidade aberta da peça de aorta com seda cirúrgico (5-0, Vömel).
Verifique a orientação da veia renal enxertos e assegurar que não haja torções.
Fixar a abertura da veia de enxerto com fio cirúrgico (Ethilon 9-0) - pela primeira vez na parte superior, em seguida, na extremidade inferior da incisão na veia cava. Fechar a incisãono sentido horário, com uma sutura contínua, usando fio cirúrgico (Ethilon 9-0), Dumont fórceps ponta angular e um porta-agulha curvo Castroviejo. Regularmente resfriar o enxerto com solução de perfusão HTK gelada.
Sentido anti-horário remover os grampos de microcirurgia, começando com a braçadeira da veia cava superior. Após a remoção da última pinça aórtica, pare cuidadosamente sangramento eventualmente leve com cotonetes. Após alguns segundos, o enxerto vai virar róseo-matizado, e contrações uretric deve aparecer.
Para a inserção do ureter na bexiga enxertos `s do destinatário remova cuidadosamente um pequeno pedaço da musculatura, na parte superior da bexiga usando uma Primavera Scissor Vannas (Student Vannas Primavera tesoura reta, Belas Tools ciência, Cat.No. 91500-09 ). Em seguida, remova o tecido circundante (principalmente gordura) do ureter enxerto Dumont usando uma pinça ponta angular. Portanto, cuidadosamente agarrar a ponta do ureter e suavemente separar a gordura, o tecido conjuntivo envolvente e os vasos incorporados from que, puxando-os no sentido oposto. Fixar a ponta uretric na extremidade de um fio cirúrgico (Prolene 6-0, Ethicon, o gato. Não. 8697H) e perfurar o topo previamente preparada da bexiga com a agulha montada. Puxar o ureter através da bexiga e sai dele na base através de uma segunda perfuração.
Fixar a anteriormente a partir do ureter tecido separado no topo da bexiga com fio cirúrgico (9-0 Ethilon). Cortar a ponta do ureter com o fio cirúrgico em anexo e puxar o ureter volta para a bexiga empurrando cuidadosamente abaixo. Em seguida, feche a segunda punção da bexiga com fio cirúrgico (Ethilon 9-0).
Feche a parede abdominal e pele por duas suturas contínuas, mas em separado, utilizando fio de sutura cirúrgica (Mersilene 0). Desinfectar a ferida com iodo Pividon e administrar a buprenorfina (0,1 mg por kg / PV / dia) sc por três dias após a cirurgia para controlar a dor da ferida.

3. Imagem Allograft Rejeição

Anestesiar ratos não submetidos a jejum utilizando isoflurano 2-2,5%.
30 MBq de FDG (30 MBq de FDG em 0,1 ml de NaCl a 0,9%) são administradas iv através de cateterização de uma veia lateral da cauda utilizando um cateter de 24 L (Braun, Introcan, 4252500-01). Depois, remover o cateter com 0,9 ml de solução de NaCl a 0,9%.
Deixe o rato em um limitador sem anestesia até o início da digitalização e hidratar o animal por iv injeção de 1 ml de solução de NaCl 0,9% por hora.
Rat Re-anestesiar utilizando isoflurano 2% imediatamente antes do exame começar.
Coloque o rato anestesiado em uma câmara de alta resolução baseada em multi-wire animais PET câmera quadHIDAC (Oxford Positron Systems Ltd, Oxford, Reino Unido). A resolução espacial do aparelho de PET é de 1,0 mm e é constante ao longo de todo o FOV (diâmetro, 165 mm, comprimento axial, a 280 mm). Monitorar e controlar a temperatura do corpo durante a varredura usando um sensor de temperatura retal e anestesia controle com um oxímetro de pulso.
Comece aquisição dinâmico para 60 mno arranque 180 min após a injecção de FDG para reduzir a acumulação de marcador nos rins provocados pela excreção renal de FDG.
Aplicar 5 MBq de ^18F-fluoreto iv e executar outra PET scan ^18, imediatamente após a injecção de F-flúor durante 60 min, sem mover a posição do rato no scanner para identificação de parênquima renal e para o cálculo de ^{18 F-5} apuramento. Reconstruir imagens de ambos os exames. Traçar manualmente um volume de interesse (VOI) em imagens reconstruídas 2 min após injeção de ¹⁸ F-flúor (em fase de perfusão) em torno do córtex renal e transferir o VOI às imagens FDG. Excluir cuidadosamente a pélvis renal do VOI. Reconstruir imagens de ambos os scans e traçar manualmente um volume de interesse (VOI) em torno do córtex renal. Dados em modo lista foram reconstruídos em imagens com um tamanho de voxel de 0,4 × 0,4 × 0,4 milímetros ^3. Excluir cuidadosamente a pélvis renal do VOI.
Calcule captação de FDG pela razão of contagem total e volume e calcular a porcentagem de dose injetada (% ID). Usamos MATLAB (Versão R2011b, MathWorks, Natick, MA, EUA) e tomográficas (TIM) Versão 2.8 para análise de imagem.