Granulócitos-dependente Blistering pele induzida por auto-anticorpos

Resumo

No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano epidermólise bolhosa adquirida (EBA) ¹.

Resumo

Fenómenos auto-imunes ocorrem em indivíduos saudáveis, mas, quando a auto-tolerância falhar, a resposta auto-imune pode resultar na patologia específica. De acordo com os postulados de Witebsky, um dos critérios para o diagnóstico de uma doença auto-imune, como seja a reprodução da doença em animais experimentais por uma transferência passiva de anticorpos. Para epidermólise bolhosa adquirida (EBA), uma doença órgão-específica protótipo auto-imune da pele e membranas mucosas, vários modelos experimentais foram recentemente estabelecida. No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano EBA ^1. Full-blown doença generalizada é normalmente visto 5-6 dias após a primeira injecção e a extensão da doença está correlacionada com a dose administrada de a collagen VII-IgG específico. A lesão tecidual (a formação de bolhas) na EBA experimental é, dependendo do recrutamento e ativação de granulócitos por tecidos ligados auto-anticorpos ^{2, -4.} Portanto, este modelo permite a dissecção da via dependente de granulócitos-inflamatório envolvido no dano de tecido auto-imune, como o modelo reproduz apenas a fase de células T independente da resposta auto-imune eferente. Além disso, o seu valor é sublinhado por uma série de estudos que demonstram o potencial de indução de blister de anticorpos in vivo e investiga o mecanismo da formação de bolhas na EBA ^{1,3, -6.} Finalmente, o modelo vai facilitar grandemente o desenvolvimento de novas terapias anti-inflamatórios em doenças induzidas por auto-anticorpos. No geral, o modelo animal passiva transferência da EBA é um modelo de doença acessível e instrutivo e vai ajudar os pesquisadores a analisar não só a patogênese EBA, mas a resposta fundamental biológica e clinicamenteperguntas essenciais autoimunidade.

Protocolo

1. Preparação de Anticorpo Pathogenic

Nota: A purificação e concentração dos anticorpos deve ser realizada no mesmo dia, na forma de anticorpos não são para ser armazenada em glicina 0,1 M pH 2,5-3 (tampão de eluição) durante a noite (ON).

A purificação por afinidade de IgG: usar 25 ml de soro de coelho imune:

1. Descongelar o soro de coelho ON a 4 ° C, mistura-a 1:1 com tampão de corrida (1xPBS) e centrifugar a 1260 ela xg durante 10 min a 20 ° C. Opcionalmente, um passo de filtração com papel de filtro pode ser incluída no processo, após a centrifugação do soro é gordurosa.
2. Enquanto isso, lava-se a proteína G matriz cheia de coluna com 10 volumes de leito (volume do leito = volume da matriz) de 1xPBS (tampão de corrida).
3. Aplicar o soro diluído e filtrou-se para a coluna e incuba-se 1 hora na plataforma de balanço à temperatura ambiente (RT).
4. Recolher o flow-through (FT) num tubo de Flacon de 50 ml. Não descartá-lo até a concentraçãoe titulação da IgG purificada é conhecido.
5. Lava-se a matriz com 5 volumes de leito de 1xPBS e, entretanto, se preparar tubos de 50 ml Falcon para recolher a fracção de IgG eluida. Pipetar 1 ml de tampão de neutralização de pH: Tris 1 M pH 10, em cada um dos tubos (caso contrário, a proporção de 01:20 de tampão TRIS em relação à quantidade de fluido a ser recolhido).
6. Aplicar 100-150 ml de tampão de eluição: glicina 0,1 M pH 2,5-3 para a coluna e recolher 50 ml fracção (s). Virar o tubo 2-3x, medir o pH e adicionar tampão de neutralização até que tenha atingido o pH 7,2-7,4.
7. Recolher gotas de fluido e IgG utilizando o tampão de eluição, como etalon medir a densidade óptica a 280 nm. Se a DO for
8. Regenerar a proteína da matriz G e armazená-la seguindo as instruções do fabricante.

Concentração por ultrafiltração Amicon com tubos:

1. Lavar o Ultra Amicon (15 ml / 30 kDa) em tubos de ultraf iltração com 1xPBS por centrifugação 15-20 minem 3220 xg, a 4 ° C. Descarte o FT do Amicon.
2. Encha as Amicons com 15 ml da fracção de IgG eluida e centrifugar durante 25-30 minutos a 3220 xg e 4 ° C, o tempo de centrifugação sempre depende do teor de proteína do eluato.
3. Descarte FT e repetir ultrafiltração até que você tem nenhuma fração eluída esquerda.
4. Lava-se a IgG concentrado extensivamente, por duas vezes, com 1xPBS 25-30 min por centrifugação.
5. Recolher o "adesivo", a solução de anticorpo amarelado a partir do filtro Amicon, num volume final de 1.500-2.000 ul de 1xPBS.
6. Concentração medida de preparação de IgG utilizando um espectrofotómetro ou NanoDrop:
   Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x factor de diluição / 1,4
7. Lavar e armazenar os Amicons seguindo as instruções do fabricante.

2. A injeção de colágeno VII IgG específica em camundongos

Antes de iniciar o procedimento real experimental, certifique-se de que o pró experimentalprotocolo é escrito e todos os materiais são preparados para o experimento.

1. Prepare as folhas de dados para o placar doença, ELISA, imunofluorescência (IF) análise e mieloperoxidase (MPO) ensaio ^4.
2. Rotular os tubos de sangue e órgãos, cryomolds bem como histologia de processamento e incorporação de cassetes.
3. As soluções de anticorpo deve ser preparado fresco ou descongelado a partir de stocks e caracterizado quanto à sua reactividade (título por microscopia de IF e / ou ELISA). A solução filtrada estéril anticorpo deve ser diluído em PBS, de forma que a dose necessária para a injecção varia entre 250-1000 ul. Certifique-se de que você tem IgG suficiente para realizar todo o experimento.
4. Preparar fresco anticoagulante heparina de 20 U / ml e 8,7 mg / ml de cetamina / xilazina 1,3 mistura mg / ml para a anestesia. Quando sacrificar os ratos têm rotulado tubos com formaldeído 3,7% preparado.
5. Esterilizar instrumentos cirúrgicos (bisturi, tesouras, ponta fina e Curvforcipes ed) e preparar seringas (seringas de insulina, 1 e 2 seringas ml), agulhas, câmera digital e cartão de memória extra.

Nota: Execute todos os procedimentos de cetamina / xilazina ou isoflurano ratos narcotizada isoflurano é a opção preferida para anestesia as verificações diárias de pele, como os ratos recuperar rapidamente.. No entanto, ao tirar fotos, 87 cetamina mg / kg e xilazina 13 mg / kg é geralmente administrado por via subcutânea. Para a eutanásia a dosagem de cetamina / xilazina é aumentada para 130 mg de cetamina / kg de xilazina e 20 mg / kg.

1. Verifique os animais já marcados para a sua saúde da pele estado geral, e da aparência da pele, pesá-los e medir a sua espessura orelha (sempre manter a mesma orelha).
2. Registre-se valores observados e mudanças na folha de avaliação clínico.
3. Recolher 20-30 ul (2-3 gotas) de sangue a partir da veia da cauda de uma seringa contendo o mesmo volume de anticoagulante.
4. Desinfectar a pele eda pele utilizando etanol a 80%.
5. Injectar a solução de anticorpo por via subcutânea na parte de trás utilizando uma seringa de insulina. (Para certos sítios (por exemplo, as orelhas) apenas pequenos volumes (10-50 ul) são viáveis ​​para ser injectada.)

As injeções devem ser repetidas a cada dois dias, quatro vezes. Balb / c e ratinhos C57BL6 de um peso corporal de aproximadamente 20 g de começar a desenvolver a doença de 3-4 dias após a primeira administração de 400-500 até 750 ug / g de peso corporal / injecção auto-anticorpos.

Ao terminar a experiência:

1. Colocar os ratos sob narcose profunda por injecção de 130 mg / kg e 20 mg / kg de cetamina / xilazina por via subcutânea, desangrar los da veia cava posterior e cortar o coração.
2. Coletar amostras de tecidos / órgãos como a pele: rabo, orelha, sangue e esôfago e colocá-los em tubos previamente identificados e PBS ou 3,7% de formaldeído preenchido.

Ao retornar para olaboratório:

1. Centrifuga-se o sangue a 1200 xg, 10 min à temperatura ambiente para separar o plasma, transferir o plasma para tubos adequadamente etiquetados e armazená-los em conformidade.
2. Incorporar o biópsia da pele em meio corte de óptima temperatura através cryomolds, devidamente etiqueta, e armazená-los a -80 ° C.
3. Coloque as amostras de tecidos destinados a histologia nos moldes de incorporação rotulados e mantê-los em formol 3,7% até parafina.

3. Avaliação clínica de gravidade da doença

Ratos devem ser examinados diariamente para lesões de pele e mucosa e os resultados devem ser registradas utilizando formulários apropriados. Os critérios para a eutanásia precoce é lesões da pele que afectam mais do que 20% da superfície do corpo e uma perda de peso de 5-10% do peso corporal total, em três dias consecutivos, contados a doença para uma pontuação de 5 (Tabela 1).

1. Posicione o mouse sobre sua barriga. Comece com a área da cabeça, ou seja, com o direitoorelha e verificar se há bolhas, erosões, crosta no interior, bem como sobre o lado exterior. Continuar da mesma maneira com a orelha esquerda.
2. Olhos direito e esquerdo são controlados por sinais de eritema, alopecia, erosões e / ou crosta.
3. Testa e área focinho são escovados através seguinte, continuando com a parte ventral do focinho, lábio e da mucosa da boca.
4. Examine a perna dianteira direita a partir da pata, movendo-se para cima; mudar para a perna dianteira esquerda. Mesmo procedimento com as pernas traseiras direita e esquerda.
5. Pincele com a pele no pescoço e nas costas com uma área de curvas pinça de ponta fina.
6. Vire o mouse em sua parte traseira e verifique a parte ventral, bem como nos lados ventral dos membros da mesma forma que anteriormente.
7. Verifique a cauda.
8. Tire fotos de partes relevantes do corpo onde os ratos desenvolvem a doença. Atenção deve ser dada à qualidade e quantidade de fotos.
9. Calcular as pontuações clínicos da doença.

4. Análise de amostras de pele e Plasma

1. Preparar, armazenar e / ou processar todos os tecidos coletados de acordo com o plano.
2. Corte cortes de tecidos congelados para se a detecção de anticorpos de coelho e rato componentes do sistema complemento.
3. Analisar o teor de proteína e de enzima diferente (ensaio de MPO) de tecidos congelados e / ou extractos de órgãos.
4. Secção do tecido embebido em parafina e coradas com H & E para visualizar a extensão do dano tecidual.
5. Analisar o plasma por ELISA, imunotransferência.

Resultados

A transferência passiva de anticorpos específicos de antigénio resulta numa doença soprado em ratinhos, assemelhando-se a níveis clínicos, histológicos e imunopatológicas, a ABE humano. Bolhas, crostas, erosões e alopecia desenvolver nas orelhas, focinho, patas, pernas, costas e ao redor dos olhos dos camundongos. Os primeiros sinais clínicos da doença, muito provavelmente aparecer nas orelhas e / ou área de cabeça. Deposição de coelho específico IgG e complemento do mouse C3 é detectado pelo IF direta na junção dermo e...

Discussão

A transferência passiva de anticorpos em animais experimentais é uma abordagem importante para a demonstração da sua patogenicidade ^{7, -12.} Os modelos animais obtidos por meio deste método, para além de ser a evidência indirecta para autoimunidade ^13, permite a investigação da fase eferente do mecanismo patogénico. O modelo de transferência passiva de anticorpos induzida pela pele de granulócitos-dependente de bolhas Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), foi usada para dissecar os mecanismos de dan...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
antigénio recombinante			A codificação de plasmídeos para as formas recombinantes do colagénio murino VII estão disponíveis a partir do autor correspondente.
soro de coelho imune	www.eurogentec.com		Tivemos coelhos New Zealand White imunizados com 200 ug de antigénio, 3 vezes em 2 semanas de intervalo. Para isso, usaram os serviços de Eurogentec SA, Bélgica.
Proteína G agarose	Roche Applied Science	11243233001
Camundongos Balb / c	Charles Ri ver Laboratories
Outubro composto, Tissue-Tek	Sakura Finetek	4583	OCT, a temperatura de corte óptima
Cryomold padrão	Sakura Finetek	4557	25 milímetros × 20 mm × 5 mm
Cryomold intermediário	Sakura Finetek	4566	15 mm × 15 mm × 5 mm
Uni-Link Einbettkassette-	R. Langenbrinck	09-0503	Histologia processamento e cassetes de incorporação
Spezial-Tatowierfarbe Schwarz	H. Hauptnerund & Richard Herberholz GmbH & Co. KG	71492000	tatuagem pasta
Tatowierzange TZ1	EBECO E. Becker & Co GmbH		tatuagem dispositivo
Heparina	Carl Roth GmbH & Co.	7692,1
De formaldeído a 37%	Carl Roth GmbH & Co.	7386
Cloridrato de cetamina	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	K2753-1G
Cloridrato de xilazina	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	X1251-1G
PBS estéril	Biochrom	L182-50
câmera digital	Nikon	Coolpix 5400
Seringa conduzida unidade de filtro de 0,45 um	Millipore
Compasso de calibre	Mitutoyo 7309	1667338	Farnell (distribuidor)
folha de pontuação doença			exemplo recintosed