Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

Resumo

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Resumo

Os métodos clássicos para o estudo de circuitos neuronais são o rendimento relativamente baixo. Vírus da pseudo-raiva transsináptica, particularmente o (PRV) e do vírus da raiva (RABV), e, mais recentemente, o vírus da estomatite vesicular (VSV), para o estudo de circuitos, está a tornar-se cada vez mais popular. Estes métodos maior rendimento use vírus que transmitem entre os neurônios em qualquer direção do anterógrada ou retrógrada.

Recentemente, um RABV modificados para monossináptico rastreio retrógrado foi desenvolvido. (Figura 1A). Neste método, o gene da glicoproteína (G) é eliminado a partir do genoma viral, e reabastecido apenas em neurónios-alvo. Especificidade infecção é conseguida por substituição de um G quimérica, composta pelo domínio extracelular do ASLV-A glicoproteína e o domínio citoplasmático da RABV-G (A RG /), para o normal RABV-G ^1. Este G quimérico especificamente infecta as células que expressam o receptor TVA ^1. O gene que codifica a TVA pode sido delivered por vários métodos ^2-8. Seguindo RABV-G infecção de um neurónio TVA-expressar, o RABV pode transmitir a outros neurónios ligados sinapticamente em sentido retrógrado, por natureza, do seu próprio G, que foi co-fornecido com o receptor TVA. Esta técnica rotula um número relativamente grande de entradas (5-10%) ² para um tipo de célula definidos, proporcionando uma amostra de todas as entradas para um tipo definido de arranque da célula.

Recentemente modifiquei esta técnica de usar VSV como traçador transsináptica ^9. VSV tem várias vantagens, incluindo a rapidez da expressão do gene. Aqui nós detalhes de um sistema viral novo rastreamento usando VSV útil para sondar microcircuitos com maior resolução. Embora as estratégias originais publicados por Wickersham et al. ⁴ e Beier et al. ⁹ rotulagem autorização de neurónios que qualquer projecto para inicialmente infectadas TVA-expressando células, aqui VSV foi concebido para transmitir apenas a TVAs células que expressam A-(Figura 1B). O vírus é primeiro pseudotipado com RABV-G para permitir a infecção de neurónios jusante da TVA-expressam os neurónios. Depois de infectar esta primeira população de células, o vírus libertado só pode infectar células que expressam TVA. Porque a propagação viral transsináptica está limitada a células que expressam TVA, presença ou ausência de ligação a partir de tipos de células definidas pode ser explorada com alta resolução. Um diagrama de fluxo experimental destas experiências é mostrado na Figura 2. Aqui nós mostramos um circuito modelo, o da direção-seletividade na retina do rato. Examinamos a conectividade das células amácrinas starburst (SACs) para as células ganglionares da retina (CGR).

Protocolo

1. Fazendo Vírus de cDNA: Recuperação de VSV a partir de ADNc, utilizando Vaccinia-T7 System ¹⁰

1. Um dia antes da experiência, as células em divisão BsrT7 prato 60 mm contendo meio DMEM + 10% FBS. Células de sementes 2E6 por prato. BsrT7 células são derivadas de BHK21, ou rim de hamster bebé, células.
2. PBS quente com 1 mM de magnésio e 1 mM de cálcio a 37 ° C.
3. Obter uma pequena alíquota vTF7-3, um vírus da vacina expressando polimerase de T7, e descongelamento à temperatura ambiente. vTF7-3 é um vírus de vaccinia infeccioso que expressa a polimerase de T7 ^11, e deve ser utilizado apenas em Biossegurança confinamento d....

Discussão

O uso de vírus para estudar circuitos neurais são um método de rendimento relativamente elevado de análise de neurónios ligados. No entanto, tanto a geração de viriões de VSV e RABV não é trivial. Embora o protocolo descrito acima, para resgatar o vírus a partir de ADNc é fornecido, é ainda um evento de baixa probabilidade. Os níveis de cada um dos N, P, e L plasmídeos necessitam de ser ajustado com precisão, e muitas tentativas e replica precisa de ser feito para assegurar resgate viral. A formação da partícula incorpo.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cultura de Tecidos
Células de rim de hamster bebê (BSRT7)	disponível mediante solicitação
vaccínia (vTF7-3)	disponível mediante solicitação
plasmídeos pN, pP, pl	disponível mediante solicitação
Cloreto de Cálcio	Sigma	C1016
Cloreto de Magnésio	Sigma	M8266
células HEK 293T	Open Biosystems	HCL4517
Prato de cultura tratado para TC de 60 mm	Corning	430166
75 cm2 Frasco de Cultura Celular com Pescoço Inclinado Retangular e Tampa Ventilada	Corning	430641
Meio: DMEM (Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco)	Invitrogen	12491-015
1 M HEPES pH 7,4	Gibo	15630-080
SFB: Soro bovino fetal	Gibco	10437-028
PKS	Invitrogen	15140-163
Reagente de Transfecção Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Seringa: seringa Luer-Lock de 5 ml	Sigma	Z248010-1PAK
Filtros de seringa	Nalgene	190-2520
PEI: PEI linear de alta potência	Polysciences	23966
Centrifugação Viral
Sistema de Filtragem a Vácuo com Tubo Corning de 150 ml, 0,45 μm Poros	Corning	430314
Tubos de ultracentrífuga Thinwall, Ultra-Claro, 38,5 ml, 25 x 89 mm	Beckman-Coulter	344058
Ultracentrífuga	Beckman-Coulter	optima XL-80K
Rotor de ultracentrífuga SW28	Beckman-Coulter	342207
Injeção em Camundongo
Micropipetas capilares	Drummond	5-000-2005
Estereotaxia	Narishige	SR-5M
Micromanipulador	Narishige	SM-15
Ump injector	World Precision Instruments	Sys-Micro4
Microcontrolador de quatro canais	World Precision Instruments	UMP3
M.TXB Motor de Bancada com Controle Digital C.EMX-1, 115 Volts	Foredom	M.TXB-EM
H.10 Peça de mão, Troca Rápida	Foredom	H.10
Broca de passo, 0,5 mm	Foredom	A-58005P
Micr–suporte para eletrodo	World Precision Instruments	MEH2S
Ketamina	Henry Schein	995-2949
Xilazina	Henry Schein	4015809TV
Buprenorfina	Henry Schein	1118217
seringa de 1 ml	Becton-Dickinson	309628
agulha de injeção 30 gauge	Becton-Dickinson	305106
Pomada Oftálmica Protetora	Doutores Foster e Smith	9N-014748
Etanol	Sigma	493511
Iodo	Sigma	PVP1
Instrumentos cirúrgicos e de dissecação
Tesoura	Fine Science Tools	91402-12
Pinça Padrão	Fine Science Tools	11000-12
Pinça Fina	Fine Science Tools	11255-20
Tesoura de Vannas	Fine Science Tools	15000-00
Manga de bisturi	Fine Science Tools	10003-12
Lâminas de bisturi	Fine Science Tools	10015-00
Pontos	Robbins Instruments	20.SK640
Dissecção e coloração com anticorpos
paraformaldeído	Sigma	P6148
Solução Salina Tamponada com Fosfato	Sigma	P4417
Triton X-100	Sigma	T9284
Soro de jumento	Jackson Imunoresearch	017-000-121
Anticorpos
Anticorpos	Millipore	AB144P
Anti-gfp	Abcam	ab13970
Anti-frango de jumento Dylight 488	Jackson Imunoresearch	703-545-155
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647	Jackson Imunoresearch	705-605-147
DAPI	Invitrogen	D1306
Montagem do tecido
Lâminas de microscópio Superfrost plus	Fisher	12-550-100
Cobertura de vidro 22 x 22, espessura 0	Electron Microscopy Sciences	72198-10
Elastômero de silicone	Rogers Corp	HT-6220
Esmalte incolor para unhas	Electron Microscopy Sciences	72180
Reagente antidesvanecimento Prolong Gold	Invitrogen	P36930