Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Summary

Estrutura cristalina de complexos DNA-proteína pode fornecer informações sobre a função da proteína, mecanismo, assim como, a natureza da interacção específica. Aqui, nós relatamos como otimizar o comprimento, a sequência e as extremidades do DNA duplex para co-cristalização com Escherichia coli SEQA, um regulador negativo da iniciação da replicação.

Abstract

Escherichia coli SEQA é um regulador negativo da replicação de ADN que impede eventos reinício prematuras por sequestrantes hemimethylated GATC aglomerados dentro da origem de replicação ^1. Para além da origem, SEQA é encontrado nos garfos de replicação, onde organiza DNA recentemente replicado em maiores estruturas ordenadas ^2. SEQA associados apenas fracamente com únicas seqüências GATC, mas forma complexos de alta afinidade com duplex de DNA contendo vários sites GATC. A unidade estrutural e funcional mínimo de SEQA é um dímero, explicando assim a exigência de pelo menos duas sequências GATC, para formar um complexo de alta afinidade com o DNA hemimethylated ^3. Além disso, a arquitectura SEQA, com a oligomerização de ligação de ADN e domínios separados por um ligante flexível, permite a ligação de repetições GATC separados por até três voltas helicoidais. Portanto, a compreensão da função de SEQA em um nível molecular requer a ana estruturallise de SEQA ligada a várias sequências GATC. Na cristalização da proteína-DNA, o DNA pode ter nenhum efeito para uma excepcional sobre as interacções de embalagem, dependendo dos tamanhos relativos e da arquitectura da proteína e DNA. Se a proteína é maior do que o DNA ou pegadas maioria do DNA, o empacotamento cristalino é primariamente mediada por interacções proteína-proteína. Por outro lado, quando a proteína é do mesmo tamanho ou menor do que o DNA ou que abrange apenas uma fracção das interacções de DNA, DNA-DNA e DNA-proteína dominar empacotamento cristalino. Por conseguinte, a cristalização do DNA-proteína complexos requer o rastreio sistemático de ⁴ ADN de comprimento e as extremidades de ADN (sem corte ou saliência) ^5-7. Neste relatório, nós descrevemos como projetar, otimizar, purificar e cristalizar duplex de DNA hemimethylated contendo repetições em tandem GATC em complexo com uma variante dimérica SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obter cristais adequados para a determinação da estrutura.

Protocol

1. Protein Purification

O ligante flexível que liga o. N-(oligomerização) e C-terminal (de ligação ao ADN), domínios de SEQA auxilia o reconhecimento de hemimethylated repete GATC separadas por 1-3 voltas sobre o DNA Para este estudo, utilizou-se uma variante de SEQA dimérica (SeqAΔ (41-59)-A25R) com um ponto de mutação no domínio N-terminal que impede ainda mais a oligomerização e um linker encurtado que restringe a ligação a DNA em tandem GATC repete separada exclusivamente pela uma vez no DNA (figura 1) ^{de 2,8.}

1. Transformar BL21 (DE3) células com o plasmídeo que codifica SEQA sob o controle do prom....

Discussion

Um dos maiores desafios em cristalografia macromolecular de raios-X é a obtenção de cristais de qualidade de difração. No caso de complexos de proteínas ou proteína-DNA, este desafio é agravado devido às variáveis ​​adicionais que devem ser optimizadas. Acredita-se que o comprimento do DNA e a presença de saliências pegajosas para melhorar associação de moléculas de DNA adjacentes a mais longo pseudo-duplex são os principais parâmetros para optimizar. No entanto, mostraram que a natureza e extensão destas saliências pod.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Catálogo #	Comentários (opcional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (TDT)	Bio Básico Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glicerina	Caledon	5350-1
Sacarose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Dodecilsulfato de sódio (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Uréia	Bioshop	URE001.5
40% Bis 29:1 / acrilamida	Bio Básico Inc.	A0007-500ml	Armazenar a 4 ° C
Ácido bórico	EMD	BX0865-1
Xileno cianol FF	Bio-Rad	161-0423
Azul de bromofenol	Bioshop	BR0222
Sistema de Gel dupla ajustável Vertical	CBC Scientific Company Inc.	DASG-250
Tela de cristalização índice	Hampton Research	HR2-144	Armazenar a 4 ° C
Assistente de tela cristalização I	Esmeralda BioSystems	EBS WIZ-1	Armazenar a 4 ° C
Assistente de tela cristalização II	Emerald BioSystems	EBS WIZ-2	Armazenar a 4 ° C
Clássicos tela cristalização	Qiagen	130701	Armazenar a 4 ° C
Bandejas Intelliplate	Arte Robbins Instruments	102-0001-00
			Soluções Tampão de purificação de proteína: 100 mM de TRIS, pH 8, EDTA 2 mM, DTT 2 mM e glicerol a 5%. Tampão de proteínas de armazenamento: Tris 20 mM pH 8, NaCl 150 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,5 mM e glicerol a 5%. Gel mistura de carga: Adicionam-se 20 g de sacarose, 25 mg de azul de bromofenol, 25 mg de xileno cianol FF, 1 ml de 10% w / v de SDS e 10 ml de TBE 10X e 70 ml de DDQ autoclavado 2 O. Agita-se com aquecimento suave até que a sacarose é dissolvido e ajustar a finalo volume a 100 ml com autoclavado DDH 2 O. Armazenar a 4 ° C. 2X tampão de carregamento: Adicionar 11 g de ureia em 10 ml de mistura de carregamento de gel. Agita-se sobre uma placa quente até que a ureia dissolve-se. Alíquota em tubos de 2 ml e armazenar a 4 ° C. Mistura PAGE 10X: Misturar 420,4 g de ureia, 100 ml de TBE 10X (autoclavada), 250 ml de 40% de 29:1 Bis / Acrilamida em DDH 2 O. Agitar até totalmente dissolvido e ajustar o volume para 1 litro. Armazenar em frascos escuros a 4 ° C. TBE 10X: Dissolver 108 g de TRIS, 55 g de ácido bórico e 9,3 g de EDTA em 1 litro de DDH 2 O. Autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Tampão de eluição: Diluir 8 ml de NaCl 5 M, 2 mL de 1 M de Tris pH 7,5, 0,4 ml de EDTA 0,5 M pH 8 em 200 ml de DDQ 2 O. Autoclave e armazenar à temperatura ambiente.