Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

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Artigo de método

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

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DOI:

10.3791/4279

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1 de dezembro de 2012

Erik R. Barthel¹ , Allison L. Speer¹ , Daniel E. Levin¹ , Frédéric G. Sala¹ , Xiaogang Hou¹ , Yasuhiro Torashima¹ , Clarence M. Wigfall¹ , Tracy C. Grikscheit¹

¹Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

Neste artigo

Resumo

Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.

Resumo

O tecido de intestino delgado (TESI) tem sido usados com sucesso para resgatar ratos Lewis após a ressecção intestinal maciça pequeno, resultando em retorno aos pesos pré-operatórios dentro de 40 dias. ¹ em humanos, a ressecção intestinal maciça pequeno pode resultar em síndrome do intestino curto, uma má absorção funcional Estado que confere significativa morbidade, mortalidade e custos de saúde, incluindo a dependência da nutrição parenteral, insuficiência hepática e cirrose, e da necessidade de transplante de órgãos multivisceral. ^{2 Neste} trabalho, descrever e documentar o nosso protocolo para criar o tecido de intestino em um modelo de camundongo com um multicelular organóides abordagem unidades-em-andaime. Unidades organóides são agregados multicelulares derivadas do intestino que contêm elementos e mucosas mesenquimal, ³ a relação entre o que preserva o nicho de células-tronco intestinal. ⁴ Na investigação em curso e futuras, a transição da nossa técnica para orato irá permitir uma investigação dos processos envolvidos na formação TESI utilizando as ferramentas transgénicas disponíveis nesta espécie. ⁵ A disponibilidade de estirpes de ratos imunodeficientes também nos permite aplicar a técnica de tecido intestinal humano e optimizar a formação de TESI humano como um xenoenxerto mouse antes de sua transição para os seres humanos. Nosso método emprega boas práticas de fabricação (BPF) reagentes e materiais que já foram aprovadas para o uso em pacientes humanos, e, portanto, oferece uma vantagem significativa sobre as abordagens que dependem de tecidos animais descelularizados. O objetivo final deste método é a sua tradução para os seres humanos como uma estratégia de medicina regenerativa terapêutica para a síndrome do intestino curto.

Protocolo

1. Preparação Unidades organóides

Instrumentos adequados para dissecção mouse (tesouras e pinças) devem ser esterilizados por autoclave.
Humanamente eutanásia do camundongo doador de acordo com os protocolos locais IACUC. Certifique-se que o animal está morto antes de prosseguir.
Fazer uma incisão na linha média para obter acesso ao interior da cavidade peritoneal. Retalhos de pele pode ser refletido como necessário para melhorar a exposição.
Estripar o intestino delgado e dividi-lo apenas distal do ligamento de Treitz. Separe o intestino delgado de seu mesentério usando afiada e dissecção romba suave. Identificar a junção ileocecal e dividir o intestino delgado 5 mm proximal ao presente.
Com uma tesoura, abrir o intestino longitudinalmente ao longo da borda antimesentérica num prato de Petri com 10 ml de 4 ° C, a solução salina tamponada estéril de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiótico-antifúngico (Anti-Anti, Invitrogen) de solução. Limpar a matéria fecal no intestino aberto comagitação suave, em seguida, transferir intestino aberto para um tubo de centrífuga de 15 ml com 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril / 1X anti-anti.
Lavar o intestino aberto três vezes em 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril 1X / anti-anti num tubo de ensaio. Cada lavagem pode ser realizada com agitação suave do tubo de 15 mL durante 30 seg. Após agitação, o tecido intestinal afunda para o fundo do tubo. Descartar o material flutuante, a qual é detritos mesenquimal. Remover a solução de lavagem cuidadosamente com uma pipeta.
Picar o intestino lavado numa placa de Petri com 10 mL de 4 ° C, HBSS estéril 1X / anti-anti-para menos do que 1 milímetro pedaços quadrados usando uma tesoura. Reúna o material picada com uma pipeta automática e colocá-lo em um tubo de ensaio.
Centrifuga-se o tubo a 500 rpm durante 8 minutos. Rejeitar o sobrenadante, que contém a gordura e mesênquima.
Digerir o material, picada lavada com 10 ml de HBSS estéril 1X / anti-anti mais 0,125 mg / ml de dispase (Invitrogen) e 800 unidades / ml colagenase tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Para preparar 40 ml da solução de digestão, pesam-se 5 mg de dispase, 142 mg de colagenase, e adicione HBSS estéril até um volume de 40 ml. Preparar esta solução recentemente cada unidade de tempo organóides são preparados, e manter a 4 ° C até estar pronto para usar. Adicionar a solução de digestão directamente para a pellet a partir do passo 1.8.
Incubar o tubo do teste contendo o material, picada lavado com a solução de digestão a 37 ° C durante 20 min.
Recuperar o tubo de ensaio e perturbar ainda mais o tecido digerido através de trituração com uma pipeta de 10 ml. Repita entre 20 a 50 vezes, até que uma aparência uniforme é obtido.
Centrifuga-se o tubo de ensaio durante 5 minutos a 800 rpm. Rejeitar o sobrenadante, que contém uma única célula.
Parar a reacção de digestão com 10 ml de 4 ° C, Modificado de Dulbecco estéril Eagle Médium (DMEM, Invitrogen) mais 10% v / v inactivado pelo calor de soro fetal bovino (HI-FBS, Invitrogen). Ressuspender o pellet e agitar o tubo.
Centrifuga-se o tubo de ensaio durante 5 minutos a 800 rpm. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta automática, até as últimas gotas. Usar uma pipeta de plástico descartável para as últimas gotas, para evitar de ressuspender o pellet.

2. Carregamento de ácido poliglicólico Andaime

Forma de 2 mm de comprimento, 5 mm de diâmetro exterior andaimes cilíndricos de ácido poliglicólico não tecido (2 mm de espessura da folha, a densidade de 60 mg cm-3; porosidade%> 95, Fibras Concordia, RI Coventry), como descrito na ref. 4.
Aparar a 2 mm distal de uma pipeta de microlitro descartável 1000 ponta com uma tesoura preparadas com 70% de etanol em água destilada.
Coloque o andaime em uma placa de cultura de quatro poços. Carregar as unidades organóides sobre o andaime com a pipeta de microlitro 1000, em primeiro lugar para dentro do lúmen e, em seguida, sobre a superfície exterior. Use uma pinça para assegurar o revestimento do lúmen. Não perturbem ou romper a forma cilíndrica do polímero.

3. Implantação em Rato Anfitrião

Utilizar um rato hospedeiro singeneico no fundo mesmo que o doador se disponível. Caso contrário, empregam um diabético não obesos imunocomprometidos / grave imunodeficiência combinada ou NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Induzir a anestesia geral com isoflurano. Barbear, preparação e armar o abdômen do rato.
Fazer uma incisão na linha média 5 milímetros para ganhar entrada para a cavidade peritoneal. Identificar e cuidadosamente estripar o omento maior. Coloque o polímero carregado no omento e envolvê-la com o tecido. Não rasgue o omento.
Fixar o polímero para o omento, com uma sutura monocryl 5-0. Suavemente o omento com o polímero enrolado na sua posição anatómica.
Feche a incisão abdominal em camadas usando suturas vicryl 4-0. Executar o fechamento muscular e tomar cuidado para não ferir as vísceras abdominais abaixo da incisão. Use suturas interrompidas para a pele.
Administrar analgesia pós-operatória, com 2 mg / kg de cetoprofeno (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) em água estéril como uma pápula subcutânea adjacente à incisão. Os animais devem ser avaliados diariamente e se o animal está a demonstrar sinais de dor ou desconforto, uma dose adicional de cetoprofeno pode ser administrada no dia 2 pós-operatórios. No terceiro dia pós-operatório, o animal deve ser totalmente recuperado, sem evidência de dor ou sofrimento. Se a dor ou sofrimento continua no dia pós-operatório 3, este é considerado anormal e deve ser tratado de acordo com os protocolos de instalação IACUC e animal de cuidados.
Permitir o mouse para recuperar e no intestino o tecido de crescer por quatro semanas. Dar ao animal o acesso ad libitum a roedores (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) e água com Septra mg a 200 mg / 5 ml 40 (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) a uma diluição de 1:100.

4. Colheita

Humanely eutanásia do animal hospedeiro quatro semanas após a implantação.
Reabrir a incisão inicial e reflectem a pele cefálica para facilitar o acesso à cavidade peritoneal.
Abrir a camada muscular e identificar a construção de tecido de engenharia como um globo de tecido.
Tome a aderência à construção a partir de vísceras intra-abdominal utilizando dissecção aguda.
Fixar o construto em formalina para posterior montagem de parafina, ou usar o tecido fresco para os ensaios bioquímicos, tais como PCR em tempo real ou de isolamento de proteínas.