Criação e injeção de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; As larvas para avaliar a virulência bacteriana

Resumo

O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo de Manduca sexta Larvas de insetos. M. sexta É um inseto disponível comercialmente e bem estudado. Assim, este método representa uma abordagem simples para analisar interacções hospedeiro-bacteriana a partir da perspectiva de um ou de ambos os parceiros.

Resumo

Manduca sexta, vulgarmente conhecido como o hornworm tabaco, é considerada uma importante praga agrícola, alimentando-se de plantas solanáceas, incluindo o tabaco e tomate. A susceptibilidade de M. sexta larvas para uma variedade de espécies bacterianas entomopatogênicos ^1-5, bem como a riqueza da informação disponível sobre o sistema imunitário do insecto ^6-8, e a sequência do genoma pendente ⁹ torná-lo um organismo modelo bom para ser utilizado no estudo de interacções hospedeiro-microorganismo durante a patogênese. Além disso, M. sexta larvas são relativamente grandes e fáceis de manipular e manter no laboratório relação a outras espécies de insetos suscetíveis. O seu grande tamanho, também facilita a extracção dos tecidos / hemolinfa eficiente para a análise da resposta do hospedeiro à infecção.

O método aqui apresentado descreve a injecção directa de bactérias no hemocelo (cavidade de sangue) de M. larvas sexta. Esta abordagempode ser utilizado para analisar e comparar as características de virulência em várias espécies bacterianas, estirpes ou mutantes, por simplesmente controlar o tempo até à morte de insectos após a injecção. Este método foi desenvolvido para o estudo da patogenicidade de Xenorhabdus Photorhabdus e espécies, que normalmente se associam com os vectores de nematóides como um meio de ganhar a entrada do insecto. Nematóides entomopatogênicos tipicamente infectar larvas através digestivo natural ou aberturas respiratórias, e liberar os seus conteúdos simbióticas bacterianas no inseto hemolinfa (sangue) pouco depois ^10. O método de injecção aqui descrito evita a necessidade de um vector nemátodo, assim, desengatar os efeitos das bactérias e nematóides sobre o insecto. Este método permite a enumeração exacta de material infeccioso (células ou proteínas) dentro do inoculo, que não é possível utilizar outros métodos existentes para a análise de entomopathogenesis, incluindo nicking ¹¹ e ensaios de toxicidade oral ¹² A utilidade do método de injecção directa, tal como descrito aqui é analisar patogênese bacteriana por monitorização da mortalidade de insectos. No entanto, este método pode ser facilmente expandido para uso no estudo dos efeitos da infecção com o M. sexta sistema imunitário. O insecto responde à infecção por meio de ambas as respostas humoral e celular. A resposta humoral inclui o reconhecimento de bactérias associadas a padrões e subsequente produção de diversos péptidos antimicrobianos ^7, a expressão de genes que codificam estes péptidos pode ser monitorizada após a infecção directa através de extração de RNA e PCR quantitativa ^13. A resposta celular à infecção envolve nodulação, encapsulamento, e a fagocitose dos agentes infecciosos por hemócitos ⁶ 13, 14.

Protocolo

1. Esterilização ovo do inseto e criação

1. Na preparação de dietas, primeiro autoclave 15 g de agar fornecida em 900-1.000 ml de H ₂ O. Imediatamente após a mistura em autoclave, com 166 g de dieta de gérmen de trigo e de mistura bem em um misturador de laboratório. Despeje em um prato (ou pratos) para esfriar, em seguida, transferir dieta para folha de alumínio, enrole firmemente, loja e a 4 ° C.
2. Após a chegada, esterilizar M. Sexta ovos com 250 ml de solução de lixívia a 0,6% durante 2-3 min em um suporte de filtro de vidro e um aparelho com um frasco de vácuo de papel filtro de 90 milímetros, agitando ocasionalmente.

Resultados

Um exemplo representativo de um ensaio de mortalidade dos insectos é descrito na Figura 3. Nesta experiência, os insectos foram injectados com cerca de 50 unidades formadoras de colónias (CFU) de um ou outro tipo selvagem (ATCC19061) ou uma estirpe mutante atenuada (lrp ¹³⁾ de Xenorhabdus nematophila crescido a fase mid-log (n = 6 por insectos estirpe). As larvas foram observadas para, aproximadamente, 72 horas, e a percentagem de insectos vivos injectados em cada instante d.......

Discussão

A injecção directa de M. sexta larvas com bactérias entomopatogênicos, como aqui descrito, serve como um meio simples e eficaz para analisar a virulência bacteriana. O método também é altamente adaptável para se adequar a diferentes sujeitos experimentais e / ou condições. As bactérias podem ser preparados de várias maneiras, antes da injecção. No caso de X. nematophila, células selvagens cultivadas em rico em nutrientes Luria-Bertani (LB) até meados de log-fase são tipicamente o mais virulento, matand.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Papel de 90 milímetros filtro	Whatman	1001 090
Vidro do porta-filtro	Millipore	XX1004700
Manduca sexta ovos	Carolina Alimentação Biológica	143880
Dieta Gypsy Moth agar +	Biomedicals MP	0296029301
5,5 onças recipientes de plástico e tampas	Empresa Individual Cup	URC55-0090-0090 PL4
1 onça recipientes de plástico e tampas	DART Container Corporation	100PC 100PCL25
1x PBS			137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM de Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4
Seringa	Hamilton	80208	Calibre 30, 0,375 "Comprimento estilo de ponto, 2