Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Resumo

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Resumo

A proteína quinase C de família (PKC) de isoenzimas está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Nossos dados recentes demonstram que PKC regula a função mitocondrial e energético celular. Numerosos relatos demonstraram que a activação de PKC-a e PKC-ε melhora a função mitocondrial do coração isquémica e medeia cardioprotecção. Em contraste, nós demonstramos que a PKC-α e PKC-ε estão envolvidos na nephrotoxicant induzida disfunção mitocondrial e morte celular em células de rim. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo in vitro de células renais mantendo ativa as funções mitocondriais em que isozimas PKC poderia ser seletivamente ativadas ou inibidas para determinar seu papel na regulação da fosforilação oxidativa e sobrevivência celular. As culturas primárias de células tubulares proximais renais (RPTC) foram cultivadas em condições melhoradas, resultando em respiração mitocondrial e atividade de mitoenzimas mitocondrial semelhantes aos descritos no RPTC in vivo. Porque as técnicas de transfecção tradicionais (Lipofectamine, electroporação) são ineficientes em culturas primárias e têm efeitos adversos sobre a função mitocondrial, PKC-ε cDNAs mutantes foram entregues a RPTC através vectores adenovirais. Esta abordagem resulta em transfecção de mais de 90% RPTC culta.

Aqui, apresentamos métodos para avaliar o papel da PKC-ε em: 1. regulação da morfologia mitocondrial e funções associadas com a síntese de ATP, e 2. sobrevivência de RPTC em cultura primária. PKC-ε é ativado pela superexpressão da constitutivamente ativa PKC-ε mutante. PKC-ε é inibida por superexpressam o mutante inactivo do ε-PKC. A função mitocondrial é avaliada examinando-se a respiração, a integridade da cadeia respiratória, as actividades dos complexos respiratórios e F ₀ F _1-ATPase, a taxa de produção de ATP, e teor de ATP. A respiração é umssessed em digitonina-permeabilizadas RPTC como o estado 3 (respiração máxima na presença de substratos em excesso e ADP) e respiração desacoplados. Integridade da cadeia respiratória é avaliada por medição das actividades de todos os quatro complexos da cadeia respiratória nas mitocôndrias isoladas. Capacidade de fosforilação oxidativa é avaliada através da medição do potencial de membrana mitocondrial, a taxa de produção de ATP, e a actividade de F ₀ F _1-ATPase. Estado de energia RPTC é avaliada através da determinação do teor de ATP intracelular. Morfologia mitocondrial em células vivas é visualizada utilizando MitoTracker Red 580, um corante fluorescente que se acumula especificamente nas mitocondrias, e monocamadas vivas são examinados sob um microscópio fluorescente. Viabilidade RPTC é avaliada através de anexina V / coloração com iodeto de propídio seguido por citometria de fluxo para determinar a apoptose e oncose.

Estes métodos permitem uma activação selectiva / inibição do indivíduo isozimas PKCpara avaliar o seu papel em funções celulares de uma variedade de condições fisiológicas e patológicas que podem ser reproduzidas em in vitro.

Protocolo

1. Isolamento de túbulos renais proximais para cultura primária

1. Anestesiar o coelho, consumo de ambos os rins e coloque-os num prato de Petri cheio com o tampão de preparação estéril (meio DMEM/F12) numa câmara de fluxo laminar.
2. Perfundir cada rim, com 50 ml de tampão de preparação, seguida de 50 ml de solução estéril tamponada com fosfato, pH 7,4 solução salina (PBS), e PBS-solução de óxido de ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulate rins e transferi-los para o buffer de preparação contendo deferoxamina.
3. Colheita do córtex de cada rim.
4. Homogeneizar o tecido utilizando um homogeneizador Dounce de 15 ml. Verter o homogenato durante 2....

Resultados

A Figura 1 mostra que a entrega adenoviral de cDNA que codifica os constitutivamente activas (caPKC-ε) e inactivos (dnPKC-ε ε) mutantes de-PKC resulta em níveis significativamente aumentados de proteínas ε-PKC em RPTC e na mitocôndria. As células infectadas com o vector de transporte cDNA caPKC ε-superexpresso a forma (activo) fosforilada da PKC-ε enquanto que as células infectadas com o cDNA que codifica sobreexpressa dnPKC-ε ε-PKC que era inactiva (não fosforilado) (Figura 1). A prese.......

Discussão

A abordagem aqui apresentada permite a super-expressão de isoenzimas individuais de PKC na cultura primária de células tubulares proximais renais. Há vários pontos fortes da presente abordagem: 1. Ela permite a investigação de mecanismos de regulação de uma população homogénea de células (células tubulares proximais renais) que são o alvo primário para vários insultos (isquemia, hipóxia, estresse oxidativo), drogas e nephrotoxicants dentro do rim. 2. Funções mitocondriais, neste modelo in vitro de RPTC cultivad.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Câmara de fluxo laminar	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 ml e 15 ml moinho de tecidos Dounce	WHEATON	989-24607, 357544
85 e 235 mícrons malha de nylon	Peças pequenas	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 ml tubo de centrífuga estéril	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
1,5 ml microtubo	Sarstedt	72.690.001
35 x 10 milímetros placas de cultura estéreis	Corning	430165
Centrífuga Jouan	Jouan	Jouan CR3 11175704 Rotores: Jouan T40
Centrífuga de micro-ajustável	SIGMA	Modelo 1-15
Monitor de Oxigênio Biológica	YSI Incorporated	YSI modelo 5300A
Único sistema de câmara de oxigênio Micro	YSI Incorporated	5356S
Sonda de oxigênio	YSI Incorporated	5331A
Circulando Bath	YSI Incorporated	5310
KCl e kit de membrana padrão	YSI Incorporated	5775
Agitador magnético	YSI Incorporated	5222
Gravador de mesa	Kipp & Zonen	BD 11E
De 48 poços e as placas de 96 poços transparentes	Costar	3548, 3679
R Thermomixer	Eppendorf	5355 21919
Orbital MAXQ 2000	Thermo Scientific	SHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (absorbância fluorescência / / luminescência leitor)	Tecan	F129005
Jaqueta de água EUA Autoflow automática incubadora de CO 2	NuAire	NU 4850
Cultura de poliestireno de 12x75 mm para tubos de ensaio de citometria de fluxo	Fisher Marca	14-961-20
Axioskop Objetiva de imersão de água 63x / 0,90 W	Carl Zeiss	114846 ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99-830 - PB
DMEM / Ham F12	Sigma	D 2906 - 1L
Mesilato deferoxamina	Hospira	D110
Colagenase tipo I	Worthington	4196
Inibidor de tripsina	Sigma	T 6522 - 500mg
5,5 ', 6,6'-tetracloro-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker Vermelho	Invitrogen	M22425
A bioluminescência ATP Ensaio Kit HS II	Roche	11 699 709 001
Anexina V - solução FITC	BioVision	1001 - 200
Citómetro	BD Biosciences	BD FACSCalibur