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Alguns plasmídeos de ocorrência natural são mantidas em células de mamíferos. Entre estes estão os genomas de gama-herpesvírus, incluindo o vírus Epstein-Barr (EBV) e Sarcoma de Kaposi associado herpesvírus (KSHV), que causam várias doenças malignas humanas 1-3. Estes dois genomas são replicadas de forma licenciada, cada um utilizando uma única proteína virai e maquinaria de replicação celular, e são passados para as células filhas durante a divisão celular, apesar de suas faltam centrómeros tradicionais 4-8.
Muito trabalho tem sido feito para caracterizar as repetições destes genomas de plasmídeos usando métodos tais como Southern blotting e hibridação in situ fluorescente (FISH). Estes métodos são limitados, no entanto. Quantitative PCR e Southern blots fornecer informações sobre o número médio de plasmídeos por célula, numa população de células. FISH é um ensaio de célula única que revela tanto o número médio e a distribuição do plasmídeo s por célula na população de células, mas é estático, não permitindo que a informação sobre os pais ou descendência da célula examinadas.
Aqui, nós descrevemos um método para a visualização de plasmídeos em células vivas. Este método baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado lactose repressor para múltiplos locais no plasmídeo de interesse 9. O DNA de interesse foi concebido de modo a incluir de cerca de 250 repetições em tandem do operador lactose (laço) sequência. LACO está especificamente ligada pela proteína do repressor de lactose (LacI), que pode ser fundido a uma proteína fluorescente. A proteína de fusão pode ser expressa a partir do plasmídeo de engenharia ou introduzido por um vector retroviral. Deste modo, as moléculas de ADN são marcados por fluorescência e, portanto, tornam-se visíveis por meio de microscopia de fluorescência. A proteína de fusão é impedido de se ligar ao DNA de plasmídeo por cultura de células na presença de IPTG até os plasmídeos estão prontos para ser visualizado. ONTEÚDO "> Este sistema permite que os plasmídeos de ser controlados em células vivas através de várias gerações, revelando as propriedades da sua síntese e separação de células filhas. ideais são células aderentes, facilmente transfectada e têm núcleos grandes. Esta técnica tem sido utilizada para determinar que 84% dos doentes com EBV-derivados plasmídeos são sintetizados cada geração e 88% da partição plasmídeos recém-sintetizado fielmente às células em células HeLa. Pairs destes plasmídeos EBV foram vistos a ser ligado a ou associado com cromatídeos irmãos após a sua síntese em S- fase até que se viu a separar como os cromatídeos irmãos separados em Anáfase 10. O método está a ser utilizado para estudar a replicação do genoma KSHV em células HeLa e células SLK. células HeLa são imortalizadas células epiteliais humanas, e as células são imortalizadas SLK endoteliais humanas células. Embora as células SLK foram originalmente derivadas de uma lesão KSHV, nem a células HeLa, nem SLK linha celular naturalmente harbgenomas ors KSHV 11. Além de estudar a replicação viral, esta técnica de visualização pode ser utilizado para investigar os efeitos da adição, remoção, ou mutação de vários elementos de ADN de sequências de síntese, localização e separação de outros DNAs de plasmídeo recombinante.