Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

Resumo

Este método novo permite a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio único adulto rato e a medição da força produzida por suas fibras musculares. A investigação combinado das propriedades eléctricas e mecânicas das unidades motoras em animais normais e geneticamente modificadas é um avanço para o estudo do sistema neuromuscular.

Resumo

O motoneurônio espinhal tem sido um sistema modelo bom para estudar a função neural, porque é um neurónio do sistema nervoso central, com as propriedades únicas de (1) tendo alvos prontamente identificáveis ​​(fibras musculares) e, portanto, tem uma função bem conhecido (para controlar a contracção muscular), (2) ser o alvo convergente de muitas redes e descendente da coluna vertebral, daí o nome de "via comum final", e (3), com uma soma grande que faz com que seja possível a penetração los com afiadas eletrodos intracelulares . Além disso, quando estudados in vivo, é possível gravar, simultaneamente, a actividade eléctrica dos motoneurónios e da força desenvolvida pelo músculo seus alvos. Realizando gravações intracelulares de motoneurónios in vivo, por conseguinte, colocar o experimentalista, na posição única de ser capaz de estudar, ao mesmo tempo, todos os compartimentos da "unidade motora" (o nome dado à motoneurónio, do seu axónio, eas fibras musculares que inerva ^1): Os insumos que incidem sobre o motoneurônio, as propriedades eletrofisiológicas do motoneurônio, eo impacto destas propriedades em função fisiológica dos neurônios motores, ou seja, a força produzida por seu motor. No entanto, esta abordagem é muito difícil, porque a preparação não pode ser paralisado e, assim, a estabilidade mecânica para a gravação intracelular é reduzida. Assim, este tipo de experiências só foi alcançado em gatos e em ratos. No entanto, o estudo dos sistemas motores espinais poderia fazer um salto formidável se que era possível realizar experiências semelhantes em ratinhos normais e geneticamente modificados.

Por razões técnicas, o estudo das redes espinhal em ratos, principalmente se limitado a neonatal em preparações in vitro, onde os neurônios motores e as redes espinhal são imaturos, os neurônios motores são separados de suas metas, e quando estudado em fatias, o MOtoneurons são separadas a maior parte das suas entradas. Até recentemente, apenas alguns grupos conseguiram realizar gravações intracelulares de motoneurônios in vivo ^2-4, incluindo a nossa equipe, que publicou uma nova preparação que nos permitiu obter gravações muito estáveis ​​de motoneurônios in vivo em camundongos adultos ^5,6. No entanto, estas gravações foram obtidos em animais paralisados, isto é, sem a possibilidade de gravar a saída força destes neurónios motores. Aqui apresentamos uma extensão da preparação original em que fomos capazes de obter gravações simultâneas das propriedades eletrofisiológicas das motoneurônios e da força desenvolvida por seu motor. Esta é uma conquista importante, pois nos permite identificar os diferentes tipos de neurônios motores com base no seu perfil de força, e revelando assim a sua função. Juntamente com modelos genéticos perturbar circuito segmentar vertebral ^7-9, ou reproduzindo doen humanaSE ^10,11, esperamos que esta técnica para ser uma ferramenta essencial para o estudo do sistema motor espinhal.

Protocolo

1. Um passo

Medicação pré-anestésica: 10-15 min antes da indução de anestesia, injetar atropina (0,20 mg / kg) e methylprenidsolone (0,05 mg) subcutaneamente para evitar salivação e edema, respectivamente.

2. Passo dois

Indução da anestesia: injectar pentobarbital sódico (70 mg / kg) ou de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente), intraperitonealmente. Deixe o rato ir até sob nenhum reflexo pitada do dedo do pé pode ser obtida. Se a anestesia parece muito leve, completar com 1/4 da dose.

3. Terceiro Passo

* Nota: esta cirurgia é um procedimento terminal.

Quando um plano cirúrgico de anestesia foi alcançada, transferir o rato sobre um cobertor aquecido levantada numa posição inclinada.

1. Cobrir o focinho do rato com uma máscara de entrega O ₂ puro com um caudal de cerca de 100 ml / min.
2. Usando uma máquina de cortar cabelo, fazer a barba na região dorsal da nuca do pescoço até a base da cauda.
3. Barbear também o membro posterior direito.
4. Virar o mouse para a posição supina, mas tome cuidado para deixar a máscara de oxigênio no local.

4. Passo Quatro

Fixar o rato no lugar com suturas looped em torno das pernas e fixado nos quatro cantos da superfície de trabalho.

5. Passo Cinco

Insira uma sonda de temperatura para monitorar a temperatura do núcleo do rato. Ajuste cobertor de aquecimento / potência da lâmpada para manter a temperatura do núcleo entre 36 ° C e 38 ° C.

6. Traqueostomia e ventilação artificial

1. Com uma tesoura sem corte, faça um corte sobre a traquéia e puxe a pele longe de ambos os lados.
2. Usando fórceps rombas, rasgar da glândula salivar de modo a expor os dois músculos finos (esterno), cobrindo a traqueia.
3. Utilizando uma pinça sem corte, separar o musc doisles ao longo da sua separação medial para revelar a traqueia.
4. Usando uma Dumont 7 fórceps, deslize dois comprimento de 4,0 fio de seda sob a traquéia.
5. Faça um corte transversal na traquéia entre dois anéis cartilaginosos, mas tome cuidado para não completamente secção da traquéia.
6. Insira o tubo traqueal para baixo da traquéia, em seguida, fixe-o em ambos os lados da abertura de inserção, amarrando as suturas sobre ele. O tubo traqueal é ligada a um ventilador de rato (SAR-830/AP, CWE Inc.) e um capnógrafo (μcapstar, CWE Inc.). O ventilador está ligado, através de um saco de cumprimento, com uma fonte de O ₂ puro. Ajustar os parâmetros do ventilador (respiração taxa de 100-150 bpm, end-tidal volume de 170-310 ul) para que o mouse não está lutando contra a ventilação artificial e da pCO final de corrente ₂ é estável entre 4 e 5%.

7. Colocação das linhas intravenosas

1. Usando técnicas de raspagem, expor a jugularveia de um lado do pescoço. A este nível, a veia jugular divide-se em dois troncos principais, as veias faciais anterior e posterior.
2. Siga os seguintes passos duas vezes, um conjunto para cada um desses troncos:
   1. Usando Dumont 4 ou 5 fórceps, separe cuidadosamente a veia do seu tecido circundante conjuntivo.
   2. Usando Dumont 7 fórceps, deslize dois comprimento de 6,0 fio de seda sob a veia. separá-los tanto quanto possível ao longo do comprimento da veia.
   3. Colocar um clipe navio pequeno no lado proximal da veia (o lado mais próximo do coração), e amarrar o lado distal da veia.
   4. Com uma tesoura muito finas íris, fazer uma pequena incisão na veia, tomando muito cuidado para não seção da veia completamente.
   5. Inserir um cateter pré-cheia 1FR (premicath, Vygon) na abertura, até o grampo do vaso.
   6. Segurando a veia eo cateter juntos em um 4 Dumont pinça, remova cuidadosamente o clipe de navio, em seguida, empurre o cateter um mor poucosmilímetros de e para a veia.
   7. Fixar o cateter, amarrando-o com as duas suturas em ambos os lados da inserção.
3. Um dos cateteres está ligada a uma seringa ou uma bomba de seringa para injectar doses suplementares de anestésico, quando necessário (normalmente a cada min 10-30). A dose IV é ou 6 mg / kg de pentobarbital de sódio ou 1250 40 ug / kg / min de cetamina / xilazina ^12. O outro cateter está ligado a uma bomba seringa para infusão intravenosa lenta (50 uL / hr) de uma solução de glucose a 4% contendo _NaHCO3 (1%) e plasmion (14%).

8. Feche a pele do pescoço com agulha e sutura, e retornar o mouse para a posição prona

9. Dissecção do músculo do membro-Hind e Nervos

1. Com uma tesoura, fazer uma incisão da parte superior da coxa ao tendão de Aquiles. Separar a pele dos músculos subjacentes, tendo o cuidado para não danificar vasos sanguíneos. Cauterizar, conforme necessário.
2. Identifique a borda anterior do músculo bíceps femoral, que aparece como uma linha branca correndo pela coxa. Com uma tesoura, abra cuidadosamente ao longo da linha do joelho todo o caminho até o osso do quadril. Separa-se os músculos. O nervo ciático é agora visível sob o bíceps femoral.
3. Dissecar cuidadosamente os bíceps femoral. Cauterizar / ligadura como necessário para evitar sangramento. O bíceps femoral pode ser totalmente removidos ou simplesmente reclinada para expor o nervo ciático e os tríceps sural músculos.
4. Dissecar o nervo sural.
5. Usando 8/0 fio de seda, amarre-se a parte distal do nervo fibular comum e cortar distal para o nó. Dissecar o nervo todo o caminho até, o mais próximo do hip possível.
6. Identificar o nervo tibial entre os nervos fibular comum e sural. Entre os diferentes ramos do nervo tibial, identificar os ramos que inervam o tríceps sural dos ramos que vão mais fundo (doravante referida como do nervo tibial).
7. Usando 8/0 sedafio, unir todos os ramos do nervo tibial, mantendo intactas as filiais da inervação do tríceps sural. Corte o nervo tibial distal ao nó e dissecar o nervo-se, tanto quanto possível.
8. Cobrir a totalidade dos membros posteriores com uma gaze embebida com uma solução salina para evitar a dessecação enquanto prosseguir com o passo seguinte.

10. Laminectomia

1. Com uma tesoura, fazer uma incisão ao longo da espinha dorsal. Separou-se a pele contra os músculos subjacentes.
2. Fazer duas incisões em cada lado das vértebras para separar os músculos subcutâneos. Em seguida, retira cada tendão dos músculos que se fixam no lado das vértebras de cada lado.
3. Utilizando uma pinça sem corte e uma cureta bem, remover o restante do músculo no lado dorsal da vértebra ao redor das apófises espinhosas de identificar claramente cada vértebra individual.
4. Identificar vértebras T13 e L1. T13 é a última vértebra ter nervuras em anexo. A coluna vertebral wdoente ser imobilizado com as Cunningham grampos da Medula Espinal vertebrais (Stoelting Co.). Colocar os grampos em cada lado da coluna vertebral de T13 e L1. Tenha cuidado para não comprimir a medula espinhal, mas colocar um pouco de tensão no eixo longitudinal. Verifique se a coluna vertebral é bem protegido, pressionando delicadamente com uma pinça.
5. Usando fórceps finos, remover as apófises espinhosas, em seguida, as lâminas durante T13 e L1, expondo assim a medula espinhal.
6. Cubra a medula espinal exposta com pequenos pedaços de algodão ou spongel embebidas com soro fisiológico para evitar a dessecação.
7. Colocar num banho de personalizado feito de plástico no topo da parte de trás, que envolve a medula espinal. Garantir o banho no local usando 4/0 fio de seda. Certifique-se que o banho é à prova d'água, selando-o com Kwik-Cast selante (WPI).
8. Uma vez que o Kwik-Cast ter secado, remova o algodão que cobre a medula espinhal, e encher o banho de óleo mineral.
9. Usando Dumont 5 pinças e tesouras muito finas íris, gentilmente puxar o companheiro durar envolve a medula espinal, e abri-lo tanto quanto possível, em ambos os sentidos. Dobrar a duração de cada lado da coluna vertebral.
10. Baixar a plataforma elevada na qual o rato é deitada de modo a mantê-lo em suspensão pelo grampo vertebral.
11. Use outro grampo vertebral para prender um processo espinhoso da região sacral para apoiar a região posterior do animal.
12. Uma braçadeira de terceiro é usado para imobilizar o membro posterior direito e tornozelo, flexionado em um ângulo de 90 ° para o joelho.

11. Aquiles Tendão Dissecção

1. Com o membro dobrado em 90 ° no joelho e no tornozelo, remover a gaze cobrindo a área dos membros posteriores, e dissecar o tendão de Aquiles livre de tecido circundante. Dissecar tanto quanto possível sural Triceps a partir de tecido circundante também.
2. Cortar o tendão do músculo plantar perto de calcâneo, depois cortá-lo novamente para remover o tendão completamente.
3. Usando uma agulha enfiada, anexar fio 6/0 através de seda ªe tendão de Aquiles e faça um nó triplo ao redor do tendão.
4. Coloque o transdutor de força perto do nó, corte a parte distal do tendão, e anexá-lo ao transdutor de força usando o fio de seda.
5. Insira dois comprimentos de fio de aço inoxidável sob a fáscia do músculo tríceps sural. Estes fios são ligados a um amplificador de AC para o registo extracelular EMG.
6. Coloque o nervo fibular comum e nervo tibial em dois eletrodos bipolares de gancho.
7. Coloque o nervo sural Triceps sobre o cátodo de um eléctrodo de gancho, com o ânodo tocar um músculo nas proximidades.
8. Conectar todos os eléctrodos de estimulação para uma unidade de isolamento.
9. Coloque um eléctrodo de bola sobre a superfície dorsal da espinal-medula, ligado a um amplificador AC extracelular para gravar os potenciais cordão dorso. Coloque um eletrodo de referência Ag / AgCl em contato com um músculo de volta.

12. Doze Passos

Estimular o nervo tríceps suralutilizando um 50 mseg pulso quadrado de intensidade crescente a uma frequência baixa (<1 Hz), até que a amplitude máxima é observada contracção. Mova lentamente o transdutor de força para esticar o músculo enquanto monitorando a amplitude da resposta de contracção até que a amplitude twitch atinge um máximo.

13. Gravações intracelulares de motoneurônios

A partir deste ponto, técnicas padrão de electrofisiológicos são usados ​​para preparar um eléctrodo intracelular, um neurónio penetrar na medula espinhal e identificá-lo como um motoneurónio.

1. Puxe uma micropipeta de vidro a uma ponta mM ~ 1 usando um extrator pipeta (P-97 Micropipeta Puller, Instrumentos de Sutter). Encher o eléctrodo com uma solução 3 M KCl (resistência do eléctrodo de 10-20 MQ).
2. Usando um micropositioner, conduzir a micropipeta, ligado a um amplificador intracelular (Axoclamp 2B, Axon Instruments) para a medula espinhal. Monitorar os potenciais de campo locais induzidas pela estimulação de e-ach nervo para localizar o pool do motor do tríceps sural.
3. Cuidadosamente aproximar motoneurónios putativas ao monitorar a resistência do microeléctrodo. Ao empurrar contra uma membrana, a resistência aumenta. Penetração algures pode ser facilitada usando o "buzz" função do amplificador intracelular.

14. Procedimento de eutanásia

No final da experiência, o animal é sacrificado com uma overdose de pentobarbital (210 mg / kg IV), seguido por decapitação.

Resultados

A Figura 1 mostra como identificar um motoneurônio do grupo tríceps sural após a penetração. Em intensidade de estimulação baixo, apenas uma EPSP monossináptico pode ser observado (Figura 1A). Com maior intensidade, o EPSP pode ser suficientemente grande para provocar uma "ortodrómica" pico (Figura 1B). Em intensidade de estimulação ainda maior, um tudo-ou-nada antidrômica espiga aparecer, com uma latência mais curta do que o EPSP monossináptico (Figur...

Discussão

A preparação descrita aqui é o primeiro que permite, no rato adulto, a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio lombar e a medição da força produzida pelas fibras musculares inervadas por seu axónio.

Devido ao pequeno tamanho do animal, as técnicas cirúrgicas necessárias para esta preparação pode ser um desafio para adquirir. No entanto, uma vez que essas capacidades são dominados, a cirurgia inteira pode ser realizada em três horas, e os animais podem sobreviver por até 7 horas m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Sulfato de atropina	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Pentobarbitona de sódio	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Cetamina
Xilazina
Glicose
Plasma expansor	Roger Bellon	Plasmagel
Tesouras cegas	FST	14079-10
Blunt tesoura fina	FST	15025-10
Vannas Primavera Tesoura	FST	15002-08
Bem fórceps serrilhada	FST	11370-32
Bem fórceps serrilhada	FST	11370-31
Cunningham Adaptador Spinal	Stoelting Co.
Kwik-Cast selante	WPI	# KWIK-CAST
Ventilador	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnógrafo	CWE Inc	μcapstar
Cobertor	Harvard Apparatus	507221F
Amplificador intracelular	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipeta extrator	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G