Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por Plasmodium falciparum infectados em uma configuração com poucos recursos

Summary

Este método investiga o fenótipo de aglutinação das plaquetas mediada Plasmodium falciparum Infectados hemácias (CHA) em isolados clínicos. Isto é realizado através do isolamento e da co-incubação do plasma rico em plaquetas e uma suspensão de CH.

Abstract

P. falciparum provoca a maioria das infecções graves de malária. Os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à malária cerebral (MC) não são totalmente compreendidos e várias hipóteses têm sido propostas, incluindo a obstrução mecânica de microvasos por P. glóbulos vermelhos falciparum-parasitados (CHA). Com efeito, durante a fase intra-eritrocítico do seu ciclo de vida, P. falciparum tem a capacidade única de modificar a superfície do eritrócito infectado por exportar antigénios de superfície com diferentes propriedades adesivas sobre a membrana de RBC. Isto permite que o sequestro de CH em múltiplos tecidos e órgãos, por adesão às células endoteliais que revestem a microvasculatura de vénulas pós-capilares ^1. Ao fazer isso, as formas maduras do parasita evitar a recarga do baço dos eritrócitos infectados deformado ² e restringir o seu ambiente mais favorável a uma pressão de oxigénio de baixo ^3. Como conseqüência deste Sequestração, é apenas parasitas assexuadas e gametócitos imaturas que podem ser detectados no sangue periférico.

Citoaderência e seqüestro de concentrado de hemácias maduro para os inúmeros receptores do hospedeiro expressas em leitos microvasculares ocorre na doença grave e sem complicações. No entanto, diversas linhas de evidência sugerem que apenas os fenótipos adesivos específicos são susceptíveis de ser associados com os resultados patológicos graves de malária. Um exemplo de tais interacções hospedeiro-parasita específicos tem sido demonstrada in vitro, em que a capacidade da molécula de adesão intercelular-1 para suportar a ligação de CH com propriedades adesivas tem sido associada ao desenvolvimento de malária cerebral ^4,5. A placenta também tem sido reconhecido como um local de acumulação de CHA preferencial em mulheres grávidas infectadas com malária, com sulfato de Condroitina A, expressos na linha sinciciotrofoblastos que o espaço intervilositário placenta como o receptor principal ^6. Rosetting t de concentrado de hemáciasÕ eritrócitos infectados através do receptor de complemento 1 (CD35) ^7,8 também tem sido associada com a doença grave ^9.

Um dos p mais recentemente descrito falciparum fenótipos citoaderência é a capacidade do CH para formar aglomerados de plaquetas mediadas in vitro. A formação de tais aglomerados CH requer CD36, uma glicoproteína expressa na superfície das plaquetas. Outro receptor humano, gC1qR/HABP1/p32, expressa em diversos tipos de células, incluindo células endoteliais e plaquetas, também tem sido demonstrado para facilitar a adesão das plaquetas CH para formar aglomerados ^10. Se a aglutinação ocorre in vivo ainda não está claro, mas pode contribuir para o acúmulo significativo de plaquetas descritos na microvasculatura do cérebro das crianças do Malauí que morreram de CM ^11. Além disso, a capacidade de isolamento clínico a aglutinar-se em culturas in vitro foi directamente relacionada com a gravidade da doença em ¹² malaviano 13, (embora não em Mali ^14).

Com vários aspectos do fenótipo aglutinação CHA mal caracterizado, estudos atuais sobre o assunto não ter seguido um procedimento padronizado. Este é um problema importante, devido à alta variabilidade inerente conhecido no ensaio de ^15. Aqui, apresentamos um método in vitro para agregação plaquetária mediada por P. falciparum com a esperança de que ele irá fornecer uma plataforma para um método consistente para outros grupos e aumentar a conscientização sobre as limitações na investigação deste fenótipo em estudos futuros. Sendo baseado no Malawi, nós fornecemos um protocolo projetado especificamente para um ambiente com recursos limitados, com a vantagem de que isolados clínicos recém-coletados podem ser examinados para fenótipo, sem necessidade de criopreservação.

Protocol

1. Coleta de Amostras

As plaquetas podem ser facilmente ativado através de temperatura, agitação ou armazenamento e, portanto, eles devem ser manuseados com cuidado. O uso de tubos sob vácuo para coleta de sangue para a preparação de plaquetas é inevitável na maioria das situações clínicas, mas deve ser cuidadosamente considerada como sucção pode causar a ativação plaquetária. Devido ao protocolo clínico utilizado em nosso hospital de pesquisa, nossas amostras são cuidadosamente recolhidos em vacutainers citrato de sódio. Nós não tiveram quaisquer problemas com a ativação plaquetária prematuro neste ou em nosso estudo anterior ^12. Nós coletamos sangue para a preparação de plaquetas do grupo sanguíneo O + indivíduos para minimizar inespecífica grupo de agregação antígeno no sangue. Os doadores também não tenham tomado medicamentos nos dias 7-10 anteriores, como alguns fármacos são conhecidos por influenciar a função das plaquetas.

1.1 Preparação de plasma rico em plaquetas (PRP)

1. Recolha cerca de 5 mlde sangue total a partir de uma série ingênua malária ou 2,5 ml de sangue do CM ou a malária grave (SM) pacientes em um vacutainer citrato de sódio (número do produto BD 36.276).
2. Centrifugar o sangue completo a 250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Não centrifugar a 4 ° C como a baixas temperaturas pode causar a agregação das plaquetas.
3. Transferir cuidadosamente o sobrenadante nublado em um tubo limpo 15 ml. Plaquetas são facilmente ativado por variações de temperatura e choques físicos e deve ser manuseado com cuidado. Evite agitação ou quaisquer movimentos bruscos do tubo.
4. Use haematocytometer um Neubauer para contar e ajustar a suspensão de plaquetas para> 300 x 10 ³ plaquetas / l para os doadores saudáveis ​​e <150 x 10 ³ plaquetas / l de CM e os pacientes SM utilizando tampão fosfato 1X (pH 7,2-7,4; PBS). Certifique-se de escolher um alto fator de diluição para facilitar a contagem de plaquetas e assegurar sua exatidão.

Nota: Malária patients ter uma contagem de plaquetas reduzida em comparação com os indivíduos saudáveis ^{​​16,17,18.} Concentrações de plaquetas, portanto, para a CM e UM são ajustados de acordo com a contagem média de plaquetas para pacientes dentro de cada grupo de diagnóstico da malária. O P. falciparum fenótipo aglutinação é comum em isolados cm e apresenta uma forte afinidade de ligação, portanto, as concentrações reduzidas de plaquetas não afeta o tamanho moita ou a freqüência em que a concentração de plaquetas é padronizado para todos os casos CM.

1.2 Preparação de plasma pobre em plaquetas (PPP)

1. Para obter o PPP, centrifugar uma porção do PRP obtido acima a 1,500 xg durante 10 min. A maioria das plaquetas são sedimentadas no fundo do tubo.
2. Ambos PRP e PPP pode ser armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Idealmente, a utilização de plaquetas frescas para o ensaio de aglutinação. Depois de 8-10 dias a maioria das plaquetas são susceptíveis de ser inactiva e, provavelmente, agregada.

2. Parasite Cultura

1. Lavar as peletizadas CH três vezes com 5-10 ml de RPMI 1640 por centrifugação a 370 xg durante 5 min.
   Nota: neste protocolo todas as culturas começou a partir de cerca de 1 ml de volume globular (VG) e mantida em 5% do hematócrito. Culturas pode ser iniciado com qualquer PCV de concentrado de hemácias e ajustado em conformidade com infectada RBC e mídia para atingir hematócrito desejado.
2. Coloque a CH num frasco de cultura e com meio de cultura de suplemento malária padrão de RPMI 1640 suplementado com HEPES 25 mM, 5% Albumax II ou soro a 10% e 40 ug / ml de gentamicina para atingir um hematócrito de 5%.
3. Permeado frascos de cultura, com uma mistura de 92,5% de azoto, 2,5% de oxigénio e 5% de dióxido de carbono antes de selar e incubar. Alternativamente, o método de jarras estanque de Trager-Jensen, pode ser utilizado.
4. Para CH obtida directamente a partir de pacientes, incubar seu frasco de cultura de 24-36 horas em 37 ° C na incubadora de _{CO2 a} 5% para obter parasitas maduros.
   NOTA: Most laboratório e as linhas de cultura adaptados são muito fácil de manter em cultura, sob condições normalizadas. Existem técnicas simples descritos abaixo, que podem ser usados ​​para sincronizar diferentes fases do parasita para manter a taxa de crescimento.
5. Preparar um esfregaço de sangue fina, conforme descrito abaixo e examinar maturação parasita sob um microscópio de luz.

3. Fina Sangue Film Deslize Preparação

1. Colocar aproximadamente 10-15 mL de sangue em uma extremidade de uma lâmina de vidro fosco em repouso numa superfície plana.
2. Toque a gota de sangue com a extremidade de uma segunda corrediça até que o sangue se espalhe uniformemente através da borda da segunda pe.
3. Enquanto mantém o segundo slide em um ângulo de 45 °, de forma rápida, mas com cuidado, sem exercer demasiada pressão sobre o primeiro slide, deslizar o sangue em todo o primeiro slide para fazer um filme fino de sangue que é uniformemente distribuído. Ar seco.
4. Mergulhe a lâmina em metanol por 10 seg. Ar seco.
5. Mergulhe a lâmina em 2% Giemsa ruaain durante pelo menos 10 min. Lavar exaustivamente até que a água corre claro. Ar seco.
6. Examinar lâmina utilizando uma lente de emulsão de óleo de 90-100x num microscópio de luz

4. Purificação e sincronização de fases assexuadas

A purificação da p maduro falciparum concentrado de hemácias é uma etapa necessária para o ensaio de aglutinação. Com efeito, só os parasitas maduros são capazes de se ligarem aos receptores de plaquetas, pois é nesta fase do ciclo de vida que os ligandos relevantes são expressos e sobressair a partir da superfície de eritrócitos infectados. Existem vários métodos para purificar e sincronizar as fases assexuadas de P. falciparum: estágios assexuados tardias podem ser enriquecidos por gradiente de Percoll ^19; célula magnética classificação ²⁰ ou usando a sedimentação gelatina protocolo ²¹ descritas aqui.. Sorbitol sincronização seleciona para estágios anelares ^22, após o que os anéis são cultivadas por 24-26 horas para obter estágios maduros (sem need para executar flotação gelatina).

4.1 Plasmagel Flotação

Plasmagel flotação utiliza solução de gelatina, como a escolha de menor peso nodoso eritrócitos permanecer em solução, enquanto as formas de toque e rosetas densas vão para o fundo. Esta técnica dá-se a 90% de pureza dos eritrócitos maduros fase infectadas e pode ser utilizado tanto para isolados de laboratório e de campo. No entanto, como mencionado anteriormente, Plasmagel flotação remove rosetas CH, bem como os estágios imaturos que poderia resultar em uma frequência aglutinação reduzida nas amostras com uma frequência elevada rosetas. No entanto, a ausência do concentrado de hemácias rosetting após Plasmagel flotação não afetaria o ensaio de aglutinação porque rosetting é uma interação de eritrócitos concentrado de hemácias e não infectados, enquanto aglomeração é concentrado de hemácias mediada por ligação por plaquetas. O ligando envolvidos nestes dois traços é diferente, com o receptor do complemento principalmente CR-1 na mediação de rosetas de eritrócitos infectados.

1. Solução Gelofusine Pré-aquecer e soro / Albumax meio II livre de até 37 ° C num banho de água.
2. Transferir a cultura para um tubo estéril de 15 ml limpos e as células por centrifugação à temperatura ambiente a 370 xg durante 5 min.
3. Sobrenadante aspirado cuidadosamente de modo a não perturbar o sedimento e ressuspender as células num volume igual de meio Gelofusine e sem proteína.
4. Transfira a mistura para um tubo estéril de 15 ml e deixa-se repousar durante 15-20 minutos em uma incubadora de 37 ° C ou até que uma demarcação clara pode ser observada entre um nível superior e inferior.
5. Transferir cuidadosamente a camada superior a um ml novo tubo estéril 15 e adicione 10 ml de RPMI fresco.
6. Centrifugar a 370 g durante 5 minutos e descartar o sobrenadante cuidadosamente.
7. Avaliar o estágio de parasitemia e de desenvolvimento por esfregaço de sangue fino e examinar sob um microscópio de luz, conforme descrito na seção 4.

NOTA: concentrado de hemácias Mature gama entre 60-90% dos eritrócitos infectados depending a parasitemia inicial da cultura. Para a alta porcentagem de parasitas maduros, utilizar culturas com uma parasitemia inicial de ≥ 10%.

5. Aglomeração Assay

1. Use haematocytometer de Neubauer para contar e ajustar a suspensão obtida após a flotação CH Plasmagel a 1 x 10 ⁸ CH / ul.
2. Em um tubo de 1,5 ml fresco, ressuspender em CH 5% de hematócrito, laranja de acridina a 20 ug / ml de concentração final e PRP em 10% do volume total.
   Em vez de laranja de acridina, cultura dos parasitas pode ser corado com 25 ug / ml de brometo de etídio durante 5 min antes da utilização.
   Por exemplo, para uma mistura de reação de 200 mL, adicione 10 ml concentrado de hemácias maduras, 20 l de 300 x 10 ³ plaquetas / mL para PRP de doadores saudáveis ​​ou 150 x 10 ³ plaquetas / l de pacientes SM e 170 mL de meio livre de proteínas.
   NOTA: A taxa de plaquetas: concentrado de hemácias nas reações finais é de 20:1. Isto é importante porque permite a máxima estáhum frequência de aglutinação de uma amostra a ser determinada. Se menos plaquetas são adicionados nos controles, então nem todos os aglomeração concentrado de hemácias pode ter a chance de moita.
3. Da mesma forma, preparar os seguintes controlos, células vermelhas do sangue não infectados e PRP, e CH com PPP para determinar o papel das plaquetas no concentrado de hemácias aglutinação.
4. Transferir a suspensão para um frasco ml com tampa de rosca cónica de 1,5-2,0.
5. Coloque o frasco sob agitação suave rolando em 10-12 rpm à temperatura ambiente.
6. Verifique se há formação de moita por um wet-slides preparados pipetando 10 ml de concentrado de hemácias ± mix de plaquetas sobre uma lâmina de vidro, cubra com um copo escorregar e examinar sob fluorescência.
7. A amostragem pode ser feita em intervalos de 15-20 min para um total de 120 min. Um grupo é considerado como um agregado de três ou mais eritrócitos infectados.

Results

Um exemplo de um ensaio de aglomeração de plaquetas mediada utilizando cerca de 70% de P. estádios maturos falciparum após o enriquecimento por Plasmagel flotação é mostrado na Figura 2. Um grupo é um conjunto de três ou mais eritrócitos infectados. A coloração com alaranjado de acridina ou brometo de etídio podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência. Laranja de acridina e espectralmente semelhante à fluoresceína, com um máximo de excitação a 502 nm e um máximo de emissão a 525 nm (verde), enquanto que o brometo de etídio tem um máximo de excitação a 493 nm e um máximo de emissão a 620 nm (semelhante aos corantes de rodamina, vermelho ). Tufos são facilmente visualizados ao microscópio sob luz normal como eles aparecem na forma de agregados celulares e sob a forma de pontos de fluorescência de verde ou vermelho, quando coradas com laranja de acridina ou brometo de etídio, corantes, respectivamente, como mostrado na figura 2 (ponto de tempo de 30 min, utilizando acridina laranja ). Quanto maiores as aglomerações, quanto maior for o agregado celular apresenta under luz normal e o maior dos pontos de verde ou vermelho em fluorescência para os respectivos corantes. Uma vez que os corantes de ADN alvo e, por conseguinte, os núcleos da mancha, plaquetas e RBC não infectadas não são detectados sob microscopia de fluorescência devido a sua falta de núcleos.

Formação aleatória de pequenos aglomerados concentrado de hemácias de 4,7 ± 1,6 concentrado de hemácias / moita ocorrer após 30 min. O tamanho de aglomerado aumenta significativamente a uma média de> 15 CH / aglomerados após incubação durante 120 min, com alguns aglomerados contendo numerosos CH / aglomeração que não puderam ser contadas visualmente. A frequência do fenótipo agregação é calculada como o número de células infectadas presentes nos aglomerados / 1000 células infectadas, contado em ensaios em duplicado.

Figura 1. O fluxo de trabalho aglomeração experimento. Platelet rich e plasma pobre em (A) e um p cultura de eritrócitos infectados com P. falciparum (B) são preparados em seguida combinados para o ensaio de aglutinação (C).

Figura 2. Aglutinação de eritrócitos infectados por P. falciparum laboratório isolar. Tufos formadas por HB3 no tempo 0, 30 e 120 minutos em plasma rico em plaquetas (A) e a formação de aglomerado pobre em plasma pobre em plaquetas (B).

Limitações do ensaio

Há limitações que afetam especificamente a função plaquetária ou resultado influência ea maioria deles já foi destacado por Arman e Rowe ^15. Aqui podemos citar alguns dos problemas potenciais que podem ser encontradas em diferent etapas do ensaio:

1. Adaptando isolados clínicos de cultura in vitro pode ser um desafio, como por vezes períodos de cultura mais longos são necessários a fim de conseguir a alta parasitemia suficiente para permitir a formação de aglomerados. Com altas taxas de variação antigênica em P. falciparum, o fenótipo adesiva da cultura adaptada parasita pode não reflectir a população de parasitas infectando original depois de tempos prolongados em cultura.
2. A fim de evitar a aglutinação não específica devido a antigénios de grupos sanguíneos, os doadores de plaquetas deve ser combinado para o antigénio de grupo sanguíneo com isolados clínicos utilizados no mesmo ensaio, ou o grupo dador de sangue universal O antigénio utilizado. No entanto, os indivíduos com o grupo sanguíneo O-são raros em sítios africanos, como Malawi e, portanto, as plaquetas comumente usados ​​são obtidos a partir de sangue do grupo O + e os doadores têm de ser adaptadas para o grupo sanguíneo.
3. Contando aglomerados em uma preparação da lâmina molhado é complicado e desafiador para captura de imagem como o cvaras estão em constante movimento. Normalmente, concentrado de hemácias acumular nas bordas da lamínula ou eles tendem a ficar juntos formando aglomerados "falsas" que podem ser facilmente confundidos com pedaços reais. A fim de reduzir o movimento de células, para permitir que as células sedimentar durante 15 minutos à temperatura ambiente antes da análise.
4. O teste de aglutinação é sensível ao tempo e, portanto, só permite uma amostra a ser analisada por pessoa em um momento de precisão ideal. Os pontos de amostragem de tempo para duas amostras diferentes podem sobrepor-se facilmente, o que resulta não correspondentes pontos de tempo de amostragem entre as amostras se manipulam mais do que uma amostra ao mesmo tempo. Em tais circunstâncias, o software quantitativas sofisticadas poderia calcular tamanhos moita ou, em alternativa, anticorpos específicos de células podem ser usadas para analisar a composição dos aglomerados. Embora estas técnicas podem melhorar significativamente a importância dos dados, em ambientes de recursos limitados sempre que tal ensaio susceptível de ser utilizado, tais técnicas e equipamentos não estão prontamente disponíveis.

Discussion

Nós descrevemos um ensaio de aglutinação das plaquetas mediada usada para estudar CH em isolados clínicos directamente no campo. Agregação de plaquetas mediada por um comportamento característico em P. isolados clínicos falciparum, foi identificado como um fenótipo adesivo distintos, frequente em isolados CD36 vinculativas ^12,23-24. Temos utilizado este ensaio para identificar três pontos principais: 1) uma forte aglomeração em fenótipo vitro de P. falciparum isolado de crianças malauianas que está associada com a gravidade da doença eo diagnóstico 2) novos receptores mediaties P-selectina de aglutinação das plaquetas com CD36, 3) o grau de trombocitopenia presente em pacientes com CM é suficiente para limitar a formação de aglomerados em CH ¹² in vitro. O envolvimento das plaquetas na formação moita é demonstrado através da análise de uma preparação wet-slide como descrito na seção 6. As plaquetas podem ser isolados a partir de PRP por centrifugação a altas velocidadesa fim de minimizar as reacções antigénicas do grupo sanguíneo, no entanto, foi utilizado PRP todo, a fim de minimizar a activação de plaquetas de um manuseamento excessivo prematuro e da centrifugação a alta velocidade. Actividade de plaquetas pode ser medida pelo teste de agregação de plaquetas utilizando agonistas de plaquetas ou epinefrina fracos, difosfato de adenosina (ADP), ²⁵ como descrito em ^26.

Existem vários aspectos do ensaio que tenham anteriormente sido mal caracterizadas, sendo um deles a importância da selecção de fontes de PRP e o efeito de antigénios de grupos sanguíneos sobre o resultado do ensaio. Preparamos PRP de indivíduos que eram do grupo sanguíneo O + e não tinha tomado qualquer medicação nos últimos 7-10 dias antes de o sangue é extraído, como alguns fármacos podem afetar o comportamento das plaquetas.

Outros fatores que podem afetar o sucesso incluem aglomeração concentrado de hemácias hematócrito, níveis de parasitemia e duração do ensaio de aglutinação. Usando o hematócrito elevado e co plaquetasUNT seria difícil dizer se o cluster é verdadeiramente uma moita ou se muitas células estão apenas sentados juntos, porque eles estão densamente ^15. A aglomeração também geralmente aumenta com o tempo de incubação mais longos. Estas são todas as orientações úteis que devem ser considerados ao projetar estudos de aglutinação.

Descobrimos que as amostras a partir de diferentes grupos clínicos podem ser analisados ​​em paralelo com o PRP a partir do mesmo doador, se é possível fazê-lo, mas em configurações de recursos limitados, tais como locais de campo da piscina transfusão é normalmente limitada. Por conseguinte, é difícil ter um único dador + O para padronizar os ensaios. Nós, portanto, identificou vários doadores + S para garantir a compatibilidade do grupo sanguíneo sempre que possível. Usando vários doadores também é útil em casos de grandes tamanhos de amostras de modo que ônus da doação de sangue não cair em apenas um indivíduo.

Os pontos de amostragem em 15-20 min são muito mais viável se um único person está realizando os ensaios, permitindo a preparação wet-slides e realizando cinética de ensaio, sem tempos de amostragem que se sobrepõem. A maioria dos dados está microscópico visual e pouco objectivo, por isso, é importante que a contagem de células é verificada por meio de mais de uma pessoa. Nesse caso, a manipulação uma amostra de cada vez pode permitir uma análise completa de 3-4 amostras por dia, dependendo da eficiência de pessoal.

Agregação de plaquetas mediada pode ser realizada utilizando tanto isolados clínicos e laboratoriais. Para as linhas de laboratório, recomenda-se que CD36 parasitas de ligação são utilizadas para maximizar frequências aglutinação. O ensaio pode ser acoplado com outros testes de aglutinação tais como a formação de rosetas, ou utilizados em ensaios de inibição de aglomeração que permitam o estudo de receptores nas plaquetas que pode mediar ligação CH, um aspecto pouco compreendido e examinadas deste fenótipo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
Laranja de acridina	Invitrogen	A3568	10 mg/ml
Gelofusina	B Braun	Gelofusina
1 M HEPES	Invitrogen	15630
Gentamicina	Invitrogen	15750045	50 mg/ml
Albumax	GIBCO	1102-037
Vacutainer de citrato de sódio	BD	362760	Capacidade de 4 ml
Microscópio invertido	Leica	MD16000 B
Microscópio fluorescente	Leica	EL6000	Contém filtros fluorescentes de luz azul e verde para laranja de acridina e brometo de etídio