Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Resumo

Larvas de Drosophila são capazes de associar estímulos odor com recompensa gustativa. Aqui nós descrevemos um paradigma comportamental simples que permite a análise da aprendizagem associativa apetitiva olfativo.

Resumo

A seguir, descrevemos os detalhes metodológicos da aprendizagem associativa apetitiva olfativo em larvas Drosophila. A configuração, em combinação com interferência genética, fornece um identificador para analisar as bases neuronais e moleculares da aprendizagem associativa especificamente no cérebro de um simples larval.

Organismos podem utilizar a experiência passada para ajustar o comportamento presente. Essa aquisição do potencial comportamental pode ser definida como a aprendizagem, e as bases físicas destes potenciais como traços de memória ^1-4. Neurocientistas tentar entender como esses processos são organizados em termos de alterações moleculares e neuronal no cérebro, usando uma variedade de métodos em organismos modelo, desde insetos aos vertebrados ^5,6. Para tais esforços é útil usar sistemas modelo que são simples e acessíveis experimentalmente. A larva Drosophila acabou por satisfazer essas demandas com base naa disponibilidade de ensaios comportamentais robustos, a existência de uma variedade de técnicas transgênicas ea organização fundamental do sistema nervoso que compreende apenas cerca de 10 mil neurônios (embora com algumas concessões: limitações cognitivas, comportamentais, poucas opções e riqueza de experiência questionável) ^7-10 .

Larvas de Drosophila podem formar associações entre odores e reforço gustativa apetitivo como o açúcar ^11-14. Num ensaio padrão, criada no laboratório de B. Gerber, os animais recebem um dois-odor formação recíproca: Um primeiro grupo de larvas é exposto a um odor que A juntamente com um reforçador gustativas (recompensa açúcar) e é subsequentemente exposto a um odor B sem reforço ^9. Enquanto isso, um segundo grupo de larvas recebe formação recíproca ao experimentar odor Um sem reforço e subsequentemente serem expostos a B odor com reforço (recompensa açúcar). A seguir ambos os grupos são tested por sua preferência entre os dois odores. Preferências relativamente mais elevadas para o odor recompensado reflectir a aprendizagem associativa - apresenta-se como um índice de desempenho (PI). A conclusão sobre a natureza associativa do índice de desempenho é atraente, porque além de a contingência entre os odores e tastants, outros parâmetros, tais como odor e exposição recompensa, passagem do tempo e manuseio não diferem entre os dois grupos ^9.

Protocolo

1. Preparação

1. Drosophila larvas tipo selvagem são criados a 25 ° C e 60% ​​a 80% de humidade num ciclo de 14/10 de luz / escuridão. Para controlar a idade exata das larvas sempre 20 fêmeas são colocados com 10 homens em um frasco (6 cm de altura e 2,5 cm de diâmetro), que inclui cerca de 6 ml de alimento mosca padrão. As moscas são permitidos para pôr ovos durante 12 horas e são transferidas para um novo frasco no segundo dia. 5-6 dias após a postura de ovos larvas atingir a alimentação 3 ^ª etapa instar se levantado a 25 ° C e pode agora ser usado para a experiência de comportamento. No entanto, tem de se assegurar que apenas tomar as larvas que estão ainda no alimento e as larvas não a partir do lado do frasco. Essas larvas já alcançaram "vagando 3 ^º instar palco" - pouco antes pupação - e seu uso dificulta a interpretação dos resultados.
2. Preparação de 2,5% de agarose pratos de Petri (outros laboratórios também usar concentrações de ágar de 1% durante todo o experimento, comoconcentrações cada vez menores podem permitir que a alimentação de larvas de 3 ^º a escavar o substrato): Dissolver 2,5 g de agarose em 100 ml DDH ₂ O. Aquece-se a solução num forno de microondas até que comece a ferver. Cuidadosamente agite a solução e colocá-lo de volta no microondas até que todos agarose é dissolvido. Verter a solução de agarose quente em placas de Petri de tal forma que o fundo das placas de Petri é completamente coberto e a solução de agarose forma uma superfície lisa. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e coloque a tampa. Não feche imediatamente as tampas, porque permitiria a condensação de água nas tampas.
3. Preparação de 2M pratos de Petri de frutose: Dissolver 2,5 g de agarose em 100 ml DDH ₂ O (de novo, o uso da concentração de ágar a 1%, é possível, no entanto, pode permitir a alimentação ³ de larvas para escavar o substrato). Aquece-se a solução num forno de microondas até que comece a ferver. Cuidadosamente agite a solução e colocá-lo de volta para o microonda até que toda a agarose é dissolvido. Adiciona-se cuidadosamente 35 g de frutose dentro da solução quente, lentamente, agitar a mistura até o açúcar se dissolver, para evitar o retardo de ebulição. Verter a solução de frutose-agarose quente em placas de Petri de tal forma que a parte inferior é completamente coberto e a solução de frutose-agarose forma uma superfície lisa. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e coloque a tampa. Não feche imediatamente as tampas, porque permitiria a condensação de água nas tampas.
4. Preparação de 1-octanol recipientes (OCT) odor: Encher 10 ul de outubro pura num recipiente de teflon feitos odor e fechar com uma tampa que tem vários furos pequenos para permitir a evaporação do odor. Uma descrição detalhada dos recipientes é dada na Gerber e Stocker 2007. Prepare três recipientes de odor para outubro Recipientes de odores para permitir a evaporação de substâncias químicas inseridas, mas evitam que as larvas podem contactar directamente com eles. Assim, as experiências aqui descritas especificamenteabordar a aprendizagem olfativa em larvas sem perturbar efeitos colaterais gustativas.
5. Preparação de recipientes amylacetate (AM) odor: Diluir AM 1:50 em óleo de parafina. Encher 10 ul da diluição num recipiente personalizado odor made Teflon e fechar com uma tampa que tem vários furos pequenos para permitir a evaporação do odor. Prepare três recipientes de odor para AM. A diluição é importante por razões de ordem prática, isto é, para evitar uma forte preferência para um odor em relação ao outro que podem mascarar uma mudança aprendizagem dependente de preferência na relação entre os dois odores. A atracção igual para ambos os odores podem ter de ser confirmadas no laboratório antes da experiência feita com o teste descrito mais tarde (2.5), com os animais naive. Os valores aqui apresentados são baseados em várias publicações do laboratório Gerber, que foram recentemente reproduzidas por nosso laboratório ^9,15,16.
6. Etiquetagem dos pratos de Petri: Antes das experiências de comportamento de todos os pratos de Petri tem de ser codificado. Isso significa que,frutose contendo placas de Petri tem que ser marcado, por exemplo, com um "X" ou um "A" e os pratos de Petri de agarose apenas com um "Y" ou "B". Este código deve ser revelada ao pesquisador somente depois que todos os dados foram gravados. Ao realizar as experiências "cegas", não é possível, portanto, que as expectativas do experimentador podem afectar o desempenho das larvas. Para facilitar a compreensão para o público grande no seguinte só vamos falar sobre os odores como estímulos condicionados (CS1 ou CS2) que, ou são recompensados ​​quando apresentado em um prato de Petri frutose (+) ou não-recompensado quando apresentado de agarose só Petri (-).

2. Formação açúcar Recompensa e Teste

1. 30 Recolha de alimentação ³ de larvas a partir de um frasco de alimentos. Transferi-los para uma placa de Petri primeiro que contém algumas gotas de água da torneira e cuidadosamente movê-los para a frente e para trás, com um pincel. Transferi-los para uma segunda placa de Petri que contém também algumas gotas de tap water de verificar que nenhuma pasta de alimentos permanece no bodywall das larvas, caso contrário larvas seria capaz de experimentar o odor de alimentos durante o experimento. Isso provavelmente obscurecer o processo de aprendizagem e seu desempenho na situação teste.
2. Formação: Para treinar larvas aos odores associados com um taco de açúcar apetitivo o seguinte regime é aplicado. Coloque um recipiente odor outubro no lado esquerdo e direito de um "X" marcado - assim, a recompensa de frutose contendo (+) placa de Petri (experimento "cego", para mais detalhes veja 1.6). Coloque o grupo de alimentação 30 3 ^o ínstar foram para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e espere por 5 min, enquanto que os animais são expostos a outubro Certifique-se de que as larvas não está preso dentro da gota de água e pode vencer a tensão superficial do mesmo. Por que as larvas podem se mover livremente sobre a placa de Petri e experimentar estímulos olfativos e / ou gustativa.
3. Formação: Remover as larvas da placa de Petri com um pincel humedecido e transferir om sobre uma placa de Petri segundo que é marcado com um "Y" - assim, agarose apenas (-) contendo prato Petri - e tem um odor AM recipiente localizado no seu lado esquerdo e direito. Fechar a tampa e espere por 5 min, enquanto que os animais são expostos a AM.
4. Formação: Repetir a 2,2) e 2,3), duas vezes, de modo que todos os 30 larvas de experiência de três ciclos de formação: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). Neste experimento CS1 representa outubro e códigos CS2 para AM.
5. Teste: Coloque um PM e um recipiente odor outubro nos sites opostos de uma placa de Petri de agarose-somente. Transfira os animais treinados para o meio do teste do prato de Petri. Fechar a tampa e espere por 5 min. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, o lado direito do meio e do prato de Petri de teste.
6. Repita os passos 2.1) a 2.5), com um segundo grupo de alimentação 30 3 ^rd larvas mas inverter os papéis experimentais de AM e outubro de tal forma que os animais recebem a formação seguinte: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). Neste experimento CS1 representa outubro e códigos CS2 para AM.
7. Arranjos possíveis para a formação. Acima apresenta-se uma formação que existe em três ensaios de formação de um ou outro OCT / (+) - AM / (-) ou no grupo recíproca também de três ensaios de formação de AM / (+) - OCT / (-). No entanto, para evitar os efeitos dependentes da sequência durante a formação, é importante variar a sequência dos estímulos em repetições seguintes da experiência completa. Através da variação da ordem CS1 ou CS2 e também a apresentação de recompensa no primeiro ou no segundo prato apresentado, quatro sequências diferentes para os ensaios de formação são possíveis:

Primeiro grupo	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Recíproco grupo	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Para evitar efeitos sistemáticos de estímulos do meio ambiente circundante experimental, deve-se realizar o teste em metade dos casos, que o OCT é apresentado do lado esquerdo e de AM para a direita. Na outra metade dos casos AM devem ser apresentados no lado esquerdo e no lado direito outubro.

3. Os testes para a tarefa relevantes sensório-motor Faculdades

O desenho das experiências acima descritas permite a análise de odor-de-açúcar de aprendizagem no tipo selvagem de alimentação ³ de larvas por si só. No entanto, os investigadores no laboratório da vida diária geralmente usam dois ou mais diferentes grupos experimentais de larvas para comparar, se a aprendizagem olfactiva depende de um pargene cular, um conjunto específico de neurónios, um estoque mutante, uma dieta de alimentos especiais, diferentes condições de criação, produtos químicos tóxicos adicionados durante o desenvolvimento, etc Assim, em todos os casos em que dois ou mais grupos experimentais de larvas são testados deve-se fazer uma conjunto de experiências de controlo obrigatórias para testar, se os diferentes grupos de larvas mostram adequadas sensório-motor acuidade. Isto torna-se obrigatória a partir fenótipos potenciais não são, necessariamente, devido às habilidades reduzidas ou abolidas aos odores associados com açúcar. Em vez disso, o potencial de defeitos de aprendizagem pode ser baseada em defeitos em qualquer etapa do circuito sensório-motora no tratamento de odores e / ou açúcar. Ou por outras palavras, se uma larva mutante não é capaz de açúcar sentido, não é possível estabelecer uma memória de açúcar. Mas isso não permite concluir que a larva não consegue aprender. Em detalhe as experiências de controle a seguir tem que ser feito para testar a adequada outubro, AM e processamento de frutose de larvas transgênico.

1. Teste para ingênuo outubro prefecia

30 Recolha de alimentação ³ de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Coloque um recipiente único odor outubro de um lado de uma placa de Petri de agarose, adicionar as larvas para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e esperar por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar para a OCT fonte de odor. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste.

2. Teste de preferência AM ingênuo

30 Recolha de alimentação ³ de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Coloque um recipiente único odor AM de um lado de uma placa de Petri de agarose, adicionar as larvas para o meio da placa de Petri, fechar a tampa e espere por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar para o AM fonte de odor. Subsequentemente contar o número de larvae no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste.

3. Teste de preferência açúcar ingênuo

30 Recolha de alimentação ³ de larvas a partir de um frasco de alimentos. Lave-os com cuidado na água da torneira, como descrito em 2.1. Preparar placas de Petri que contêm 2,5% de agarose, de metade e de uma mistura de frutose-agarose 2M na outra metade. Adicionar as larvas para a placa de Petri, fechar a tampa e esperar por 5 min, de tal modo que as larvas podem rastejar sobre a placa de Petri e orientar em direcção ao lado de frutose, contendo. Subsequentemente contar o número de larvas no lado esquerdo, no meio e no lado direito do prato de Petri de teste.

Preparação de pratos de Petri de meia meia: Preparar placas normais de agarose como descrito acima na secção 1.2. Quando a agarose pratos de Petri são cheias arrefecido, corte cuidadosamente o agarose ao longo do eixo vertical, com um bisturi. Remova um meio de agarose a partir de uma placa de Petri. Add uma solução de frutose-agarose quente (para a preparação ver 1.3), com a meia vazia da placa de Petri. Tenha cuidado para que as duas metades corresponder e não formar uma borda definida - isso afeta o comportamento de escolha larval e torna uma análise comportamental bastante difícil ^4..

Sham treinamento

Apesar dos testes se a alimentação transgênica 3 ^ª larvas são capazes de distinguir em um nível tipo selvagem entre outubro e ar (3,1), AM e ar (3,2) e açúcar e agarose pura (3,3), um conjunto adicional de experimentos de teste foi recentemente introduzido (para discussão ver Gerber e Stocker, 2007). O racional para estas experiências é o seguinte. Durante a formação das larvas passam por tratamento sucessivo em massa e odor e açúcar estimulação. Assim, é bem possível que o fenótipo observado aprendizagem é enganador (embora naïve odor e testes de percepção de açúcar estão num nível de tipo selvagem!). De facto, é possível que os animais transgénicos differ de larvas do tipo selvagem em relação à resistência ao estresse, motivação, adaptação, fadiga sensorial, a aprendizagem contextual, e as mudanças na saciedade. Assim, Michels et al. (2005) introduziu controles que testam se um mutante dado é capaz de (1) detectar AM versus um recipiente vazio odor se você tratar as larvas exatamente como durante o treinamento, exceto que você omitir a recompensa e apenas expor a tanto odores; (2) detectar outubro, após o mesmo regime, (3) detectar AM versus um recipiente vazio odor, se você tratar as larvas de uma forma de treinamento de como não ser que você omitir os odores e apenas expor a recompensa, e (4 ) detectar PTU após o mesmo regime. Para uma discussão abrangente e mais detalhes sobre os métodos consulte Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007).

4. Análise de Dados para a Aprendizagem Recompensa Açúcar

1. Para avaliar os dados do protocolo de aprendizagem açúcar recompensa calcular um índice de preferência OCT (PREF OCT) para cada um dos dois reciprocidadecamente grupos formados:
   Para o primeiro grupo que recebeu outubro / (+) - AM / (-) formação:
   PREF outubro (outubro + /-AM) = (n º de larvas do lado de outubro - # de larvas do lado AM) / n º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio
   Para o segundo grupo que recebeu AM / (+) - OCT / (-) formação:
   PREF AM (+ / outubro) = (n º de larvas em AM lado - N º de larvas do lado de outubro) / n º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio

2. Calcular um índice de desempenho (PI) para os dois valores PREF de 4,1). O PI representa aprendizagem associativa por anulando efeitos perturbadores de odor e exposição punição, passagem do tempo e manipulação:
   PI = (PREF outubro (outubro + / AM) + PREF AM (+ / outubro)) / 2
   Assim PIs pode variar de -1 a 1. Valores significativamente negativos representam aversivo de aprendizagem, enquanto que valores significativamente positivos descrever aprendizagem apetitiva. Um experimento completo geralmente é composto por 10 ou mais IPs. Os dados são visualizados como includin parcelas caixag todos os valores de um dado grupo experimental. 50% dos valores de estar localizado no interior da caixa, o índice de desempenho mediano é indicado como uma linha a negrito no interior da caixa de bigodes.

5. Análise de Dados para a Tarefa relevantes sensório-motor Faculdades

1. Para avaliar os dados ao testar para o processamento adequado odor outubro calcular um índice de preferência outubro odor da seguinte forma:
   Odor PREF outubro = (# de larvas no lado OCT - # de larvas no outro lado) / n º de todas as larvas no interior das zonas esquerda, direita e metade
2. Para avaliar os dados quando o teste de percepção de odor adequada AM AM calcular um índice de preferência odor da seguinte forma:
   Odor PREF AM = (# de larvas no lado AM - # de larvas no outro lado) / n º de todas as larvas no interior das zonas esquerda, direita e metade
3. Para avaliar os dados ao testar para a percepção adequada frutose calcular um índice de preferência de frutose como segue:
   PREF frutose = (# de larvas no lado frutose - # de larvas no outro lado) / N º de todas as larvas no interior das zonas de esquerda, direita e meio
4. Detalhes para a formação farsa são dadas em Michels et al. 2005.

Resultados

Figura 1A mostra uma visão geral dos procedimentos experimentais para a aprendizagem olfativa larval associativo. Por emparelhamento de um dos dois odores apresentados com uma recompensa larvas açúcar adquirir o comportamento potencial para expressar uma resposta atraente para o odor recompensado em comparação com o odor recompensa. Dois grupos de larvas são sempre treinados por qualquer emparelhar o reforço com o odor outubro ou AM. O índice de desempenho (PI) mede a função associativo como a diferença...

Discussão

A configuração descrita em larvas Drosophila permite a investigação sobre a aprendizagem associativa olfativa dentro de um cérebro comparativamente elementar. A abordagem é simples, barato, fácil de estabelecer em um laboratório e não requer equipamentos de alta tecnologia ^9. Nós apresentamos uma versão do experimento, para estudar a aprendizagem associativa apetitiva reforçado pela recompensa frutose ^11. A configuração descrita baseia-se numa série de estudos paramétricos que exaust...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Número CAS
Frutose	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Agarose	Sigma	A5093	9012-36-6
1-octanol	Sigma	12012	111-87-5
Amylacetate	Sigma	46022	628-63-7
Petróleo	Sigma	18512	8012-95-1