A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através<em&gt; E. coli</em

Ming Jiang; Haoran Zhang; Blaine A. Pfeifer

doi:10.3791/4346

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Artigo de método

A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através

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DOI:

10.3791/4346

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13 de janeiro de 2013

Ming Jiang¹ , Haoran Zhang² , Blaine A. Pfeifer¹

¹Chemical and Biological Engineering Department, State University of New York at Buffalo, ²Chemical Engineering Department, Massachusetts Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

A biossíntese heteróloga da eritromicina A através E. coli Inclui as seguintes etapas experimentais: 1) transferência genética, 2) reconstituição heteróloga, e 3) a análise do produto. Cada passo será explicado no contexto da motivação, potencial e desafios na produção de produtos naturais terapêuticos usando E. coli Como anfitrião substituto.

Resumo

A produção heteróloga de complexos produtos naturais é uma abordagem destinada a abordar as limitações atuais e possibilidades futuras. É particularmente útil para aqueles compostos que possuem um valor terapêutico, mas não pode ser suficientemente produzido ou beneficiaria de uma forma melhorada de produção. Os procedimentos experimentais envolvidos podem ser subdivididos em três componentes: 1) de transferência genética, 2) reconstituição heteróloga e 3) a análise do produto. Cada componente experimental está sob otimização contínua para enfrentar os desafios e antecipar as oportunidades associadas com esta abordagem emergentes.

Biossíntese heteróloga começa com a identificação de uma sequência genética responsável por um produto de elevado valor natural. Transferindo esta sequência para um hospedeiro heterólogo é complicado pela complexidade via biossintética responsável pela formação de produto. O antibiótico eritromicina A é um bom exemplo. Vinte genes (totalizando> 50 kb) são necessários para a biossíntese de eventual. Além disso, os três destes genes codificam megasynthases, multi-domínio enzimas cada ~ 300 kDa de tamanho. Este material genético deve ser concebida e transferido para E. coli para a biossíntese de reconstituída. A utilização de PCR isolamento, construção operon, multi-cystronic plasmídeos e transformação de electro-será descrito na transferência da eritromicina A aglomerado genético para E. coli.

Uma vez transferido, a E. coli deve suportar biossíntese eventual. Este processo é também um desafio, dadas as diferenças substanciais entre E. coli ea maioria dos hospedeiros originais responsáveis pela formação do produto complexo natural. A célula deve fornecer substratos necessários para apoiar a biossíntese e coordenadamente expressar o cluster transferido genética para produzir enzimas ativas. No caso da eritromicina A, a E. coli teve de ser concebida para fornecer os dois precursores (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA), necessários para a biossíntese. Além disso, as modificações genéticas de sequência, o número de cópias do plasmídeo, chaperonina co-expressão, modificação pós-traducional, e temperatura enzimática processo também foram necessárias para permitir que a eritromicina A formação definitiva.

Finalmente, a produção de sucesso deve ser avaliado. Para a eritromicina Um caso, vamos apresentar dois métodos. A primeira é a cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) para confirmar e quantificar a produção. A bioactividade da eritromicina A também ser confirmada através da utilização de um bioensaio em que a actividade antibiótica é testado contra Bacillus subtilis. Os ensaios de avaliação estabelecem eritromicina A biossíntese de E. coli e preparou o terreno para futuros esforços de engenharia para melhorar ou diversificar a produção e para a produção de novos complexos compostos naturais usando essa abordagem.

Introdução

A eritromicina A é um antibiótico de policétido produzido pelo Gram-positiva do solo bactéria Saccharopolyspora erythraea, e na produção de corrente foi incrementalmente melhorado a ~ 10 g / L através de décadas de mutagénese tradicional e protocolos de rastreio e, mais recentemente, através de esquemas de processo de optimização ^1-6. Estratégias de mutagénese e de rastreio são comuns no desenvolvimento do produto antibiótico natural como resultado da dificuldade de cultivo e / ou manipular geneticamente hospedeiros nativos e de produção, devido à actividade antibiótica prontamente disponíveis ou fenótipos de crescimento melhoradas para auxiliar a....