Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

Katerina Tsilingiri; Angelica Sonzogni; Flavio Caprioli; Maria Rescigno

doi:10.3791/4368

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Artigo de método

Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

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DOI:

10.3791/4368

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1 de maio de 2013

Katerina Tsilingiri¹ , Angelica Sonzogni² , Flavio Caprioli³ , Maria Rescigno¹

¹Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, European Institute of Oncology, ³U.O. Gastroenterologia 2, IRCCS Ca' Granda, Ospedale Policlinico di Milano

Neste artigo

Resumo

Introduzimos um novo método para a manutenção da mucosa intestinal humana em cultura e monitorização da resposta a vários tipos de estímulos durante pelo menos 24 horas. Com o nosso método, a polaridade do tecido é mantida, o que permite um estímulo fisiológico por via apical.

Resumo

Existem poucos modelos atualmente para simular realisticamente micro-ambiente do complexo do intestino humano, onde uma variedade de interações ocorrem. Homeostase adequada depende directamente estas interacções, visto que todo modelar uma resposta imunológica induzir tolerância contra os antigénios dos alimentos, enquanto ao mesmo tempo de montagem respostas imunes eficazes contra micróbios patogénicos acidentalmente ingeridas com alimentos.

Homeostase intestinal também é preservada através de várias interacções complexas entre a microbiota (incluindo as estirpes bacterianas benéficas associadas ao alimento) e do hospedeiro, que regulam a fixação / degradação do muco, da produção dos péptidos antimicrobianos, através da barreira epitelial, e a "formação" do células epiteliais ", que controla o fenótipo tolerogenic ou imunogênica de únicas, gut-residentes células linfóides das populações. Estas interacções têm sido muito difíceis de reproduzir com ensaios in vitroutilizando quer linhas de células cultivadas ou de células mononucleares do sangue periférico. Além disso, os modelos de rato diferem substancialmente em componentes da mucosa intestinal (organização da camada de muco, a comunidade de bactérias comensais) com respeito ao intestino humano. Assim, os estudos de uma grande variedade de tratamentos para ser interpostos nas clínicas para as condições relacionadas com o stress ou patológicos importantes, tais como a síndrome do intestino irritável, doença inflamatória do intestino ou o cancro colo-rectal têm sido difíceis de realizar.

Para tratar dessas questões, foi desenvolvido um novo sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana, que mantêm o seu in situ condicionado pela microbiota de acolhimento e resposta imune, de forma polarizada. Estimulação apical polarizada é de grande importância para o resultado da resposta imunitária induzida. Tem sido repetidamente demonstrado que os mesmos estímulos podem produzir respostas completamente diferentes quando ignorar a cara apical do epi intestinalthelium, estimulando as células epiteliais basolateralmente ou entrar em contato direto com os componentes da lâmina própria, mudando o fenótipo de tolerogenic para imunogênica e causando inflamação excessiva e desnecessária na área.

Conseguimos estimulação polarizada por colagem de um cilindro caverna que a área delimitada da estimulação na cara apical da mucosa, como será descrito no protocolo. Nós usamos este modelo para examinar, entre outros, os efeitos diferenciais de três estirpes diferentes de bactérias lácticas. Mostramos que este modelo de sistema é muito poderoso para avaliar as propriedades imunomoduladoras de probióticos em condições saudáveis e doença.

Protocolo

1. Obtenção e Preparação do tecido

Tissue (saudável ou IBD mucosa) é obtido durante a cirurgia. Quando a amostra é excisada transferência para o laboratório, logo que possível, mantendo-o em Ca ^{+ +} / Mg ^{+ +} tampão HBSS suplementado com Pen / Strep a 4 ° C ou sobre gelo.

* O tamanho da amostra depende da disponibilidade do tecido: a parte do tecido obtido, é que não é estritamente necessária para o diagnóstico e pode variar bastante entre indivíduos saudáveis e IBD. Tecido sadio é retirado de pacientes submetidos à cirurgia de câncer de cólon.

Lave o tecido com cuidado e limpe-o de todo o material mesentérica. Separa-se a camada mucosa a partir da submucosa utilizando tesouras e pinças esterilizadas, mantendo o tecido em tampão HBSS numa placa de Petri (não necessariamente imersas). Tocar a superfície da mucosa com a pinça tão pouco quanto possível.
Corte mucosa em listras pelo menos um cm de largura e tanto tempo quanto possível. Utilize dois bisturis estéreis, tanto quanto se estivesse cortando seu alimento.
Lavar limpar suavemente mucosa em HBSS e estendê-la numa placa de Petri, com o lado apical voltada para cima.

2. Montagem do Tissue

Prepare meio fresco (tisDMEM). Use DMEM suplementado com glutamina (2 mM) e de NaPyr (1 mM), e adicionar 15% de FBS-Na (Fetal Bovine Serum - norte-americana), 1% de ITS-X e de 200 ng / ml de EGF, no momento da utilização.
Encha de 10 cm de uma placa de Petri com o resto da SBF-Na (cerca de 30 ml de utilizar de modo a que as redes de metal será completamente submersa) e submergir as grelhas de metal. Mantenha a placa de abrir e apoiar os cilindros de plástico em sua torneira.

* As grades de metal são feitos de ferro. A malha é de forma quadrada com um lado de 0,5 mm.

Aqui 3 ul de cola cirúrgica com uma pipeta de 10 ou 20 ul. Aplique-o cuidadosamente a uma das fronteiras de um cilindro de plástico, mantendo-fIRM com a pinça.
Suavemente colocar o cilindro no lado apical da mucosa, tal como próximo de uma das bordas da tira possível.
Para se obter o tempo de cola para fixar firmemente o cilindro sobre o tecido, se preparar a placa de cultura de órgãos de centro bem: Pipetar 850 mL-1 ul do meio no centro do poço e apoiar a grade de metal nas bordas da cavidade central da placa.
Corte o excesso de tecido das bordas do cilindro usando dois bisturis estéreis como antes.
Suavemente levantar o cilindro com o tecido ligado e colocar o lado basolateral da grelha de metal no centro do prato.

3. Estimulação

Use os estímulos de sua escolha em sua concentração preferido.
Aplicar volume apropriado no centro do cilindro de plástico, sem perturbar o cilindro ou a superfície da mucosa com a ponta da pipeta. Verifique se o seu volume de escolhido cobre uniformemente a superfície interna do cilindro. Emvolumes dicated:
Cilindro de plástico grande: 200 ul
Médio plástico do cilindro: 100 mL
Cilindro de plástico de pequeno porte: 50 ul
Incubar por até 3 horas em uma incubadora convencional.

* Se você deseja incubar por momentos mais longos, certifique-se de usar um volume muito menor de estímulos (10-20 mL) e coloque diretamente no tecido em uma atmosfera de 100% O ₂ na pressão de 1 atm (ver 3.5) .

Tome o meio com os estímulos fora da superfície apical do tecido e não substitui com meio fresco, porque o tecido não se cansa O ₂ se uma espessa camada de meio na face apical impede a troca gasosa. Cubra o prato.
Colocar o tecido numa atmosfera de 100% _de O2 na pressão de 1 atm.

4. Colheita

Depois de 24 horas de tempo de cultivo total (± 2,5 hr) retire cuidadosamente o cilindro a partir de diade tecido e com a ajuda de um escalpelo cola raspando suavemente e armazená-lo em função da análise desejada (corrigir para imuno-histoquímica e / ou ensaios de imunofluorescência, encaixe ou por congelamento em N2 líquido para purificação de RNA e de perfis de expressão de genes ou a purificação de proteínas e ensaios de Western blot ).
Colha o meio basolateral para o perfil de secreção de citocinas. Centrifugar a 8000 rpm durante 7 min para detritos da pelota, transferir o sobrenadante num tubo Eppendorf (alternativamente aliquota) imediatamente e armazenar a -20 ° C.

* Se você quiser manter sobrenadantes por mais tempo, armazená-los à temperatura de -80 ° C.