Introduzimos um novo método para a manutenção da mucosa intestinal humana em cultura e monitorização da resposta a vários tipos de estímulos durante pelo menos 24 horas. Com o nosso método, a polaridade do tecido é mantida, o que permite um estímulo fisiológico por via apical.
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Artigo de método
Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Existem poucos modelos atualmente para simular realisticamente micro-ambiente do complexo do intestino humano, onde uma variedade de interações ocorrem. Homeostase adequada depende directamente estas interacções, visto que todo modelar uma resposta imunológica induzir tolerância contra os antigénios dos alimentos, enquanto ao mesmo tempo de montagem respostas imunes eficazes contra micróbios patogénicos acidentalmente ingeridas com alimentos.
Homeostase intestinal também é preservada através de várias interacções complexas entre a microbiota (incluindo as estirpes bacterianas benéficas associadas ao alimento) e do hospedeiro, que regulam a fixação / degradação do muco, da produção dos péptidos antimicrobianos, através da barreira epitelial, e a "formação" do células epiteliais ", que controla o fenótipo tolerogenic ou imunogênica de únicas, gut-residentes células linfóides das populações. Estas interacções têm sido muito difíceis de reproduzir com ensaios in vitroutilizando quer linhas de células cultivadas ou de células mononucleares do sangue periférico. Além disso, os modelos de rato diferem substancialmente em componentes da mucosa intestinal (organização da camada de muco, a comunidade de bactérias comensais) com respeito ao intestino humano. Assim, os estudos de uma grande variedade de tratamentos para ser interpostos nas clínicas para as condições relacionadas com o stress ou patológicos importantes, tais como a síndrome do intestino irritável, doença inflamatória do intestino ou o cancro colo-rectal têm sido difíceis de realizar.
Para tratar dessas questões, foi desenvolvido um novo sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana, que mantêm o seu in situ condicionado pela microbiota de acolhimento e resposta imune, de forma polarizada. Estimulação apical polarizada é de grande importância para o resultado da resposta imunitária induzida. Tem sido repetidamente demonstrado que os mesmos estímulos podem produzir respostas completamente diferentes quando ignorar a cara apical do epi intestinalthelium, estimulando as células epiteliais basolateralmente ou entrar em contato direto com os componentes da lâmina própria, mudando o fenótipo de tolerogenic para imunogênica e causando inflamação excessiva e desnecessária na área.
Conseguimos estimulação polarizada por colagem de um cilindro caverna que a área delimitada da estimulação na cara apical da mucosa, como será descrito no protocolo. Nós usamos este modelo para examinar, entre outros, os efeitos diferenciais de três estirpes diferentes de bactérias lácticas. Mostramos que este modelo de sistema é muito poderoso para avaliar as propriedades imunomoduladoras de probióticos em condições saudáveis e doença.
Protocolo
1. Obtenção e Preparação do tecido
- Tissue (saudável ou IBD mucosa) é obtido durante a cirurgia. Quando a amostra é excisada transferência para o laboratório, logo que possível, mantendo-o em Ca + + / Mg + + tampão HBSS suplementado com Pen / Strep a 4 ° C ou sobre gelo.
* O tamanho da amostra depende da disponibilidade do tecido: a parte do tecido obtido, é que não é estritamente necessária para o diagnóstico e pode variar bastante entre indivíduos saudáveis e IBD. Tecido sadio é retirado de pacientes submetidos à cirurgia de câncer de cólon.
- Lave o tecido com cuidado e limpe....
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Resultados
Conseguimos manter a mucosa intestinal humana saudável e IBD em cultura por pelo menos 24 horas preservando o bem-estar do tecido. Em conformidade com as observações anteriores 1, isto foi apenas possível se a maior parte do tempo de cultura (de pelo menos 85% do total) foi realizada em O 2, tal como o tecido não sobreviveram durante 24 horas em incubadoras convencionais (Figura 2). Mostramos também que as diferentes respostas de explantes pode ser observado neste modelo, dependend.......
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Discussão
A necessidade de modelos fisiologicamente relevantes em que os tratamentos para mucosa intestinal humana pode ser validamente testados tem sido enfatizada. Muitos pesquisadores têm identificado potenciais artefatos e defeitos tanto na célula 5 e 6 modelos de mouse usado até agora para esse fim. Na verdade, mesmo que os dados pré-clínicos promissores é muitas vezes obtido, estes raramente se traduzem em benefícios clínicos significativos.
O método descrito neste trabalho.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos Erika Mileti para excelente suporte técnico e Dr. Antonio Di Sabatino para fornecer as câmaras de oxigênio.
Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações do sétimo programa-quadro da UE (IBDase, ERC: Dendroworld) e Fundação Cariplo para MR e suporte por um Curie rede de mobilidade internacional de formação Marie (Cross-Talk, subvenção No: 21553-2) para KT.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| HBSS 10X | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamicina | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| ITS-X 100X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamina | Lonza | BE17605E | |
| Aminoácidos não essenciais 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materiais | |||
| Cilindros de clonagem 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cilindros de clonagem 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cilindros de clonagem 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Grades metálicas | Produzido no local | ||
| Placa de cultura de órgãos com poço central | BD Falcon | 353037 | |
| Cola cirúrgica (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Potes de oxigênio | Produzido no local | ||
| Botijões de oxigênio | Air Liquid Sanità |
Referências
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al.
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Reimpressões e permissões
