Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

Resumo

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Resumo

O processo pelo qual a região anterior da placa neural dá origem à retina de vertebrados continua a ser um dos principais focos da investigação clínica e básica. Para além da óbvia importância médica para compreender e tratar doenças da retina, o desenvolvimento da retina de vertebrados continua a funcionar como um sistema modelo importante e elegante para compreender a determinação de células neuronais do tipo e da diferenciação ^1-16. A retina neural é composto por seis tipos de células discretas (gânglio, fotorreceptores amácrinas, horizontal, células bipolares e células gliais de Müller) dispostos em camadas estereotipados, um padrão que é largamente conservada entre todos os vertebrados ^12,14-18.

Enquanto estudava a retina no embrião intacto desenvolvimento é claramente necessária para a compreensão de como este órgão complexo desenvolve a partir de uma saliência do cérebro anterior em uma estrutura de camadas, há muitas questões que beneficiam from empregando abordagens utilizando cultura de células primária de presumíveis células da retina ^7,19-23. Por exemplo, analisando as células a partir de tecidos removidos e dissociados em diferentes fases permite discernir o estado da especificação de células individuais, em diferentes fases de desenvolvimento, isto é, o destino das células na ausência de interacções com os tecidos vizinhos ^{8,19-22 ,24-33.} Cultura primária de células também permite que o investigador para tratar a cultura com os reagentes específicos e analisar os resultados de um nível da célula individual ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, um sistema modelo para o estudo clássico de desenvolvimento neural precoce ^{19,27,29,31-32,40-42,} serve como um sistema particularmente adequado para a cultura de células da retina primário ^10,38,43-45.

Tecido da retina presuntivo é acessível desde as primeiras fases de desenvolvimento, imediatamente após a indução neural ^25,38,43. Além disso, dada ªem cada célula no embrião contém uma fonte de gema de ovo, as células da retina pode ser cultivada em um meio muito simples definidos que consistem de uma solução salina tamponada, eliminando assim os efeitos de confusão de incubação ou outros produtos à base de soro ^10,24,44-45 .

No entanto, o isolamento do tecido da retina de tecidos circundantes e o processamento subsequente é um desafio. A seguir, apresentamos um processo para a dissecção e dissociação de células da retina em Xenopus laevis que serão utilizadas para preparar culturas de células primárias que, por sua vez, ser analisados ​​para a actividade de cálcio e a expressão do gene com a resolução de células simples. Embora o tema apresentado neste artigo é a análise de transientes de cálcio espontâneas, a técnica é amplamente aplicável a uma grande variedade de questões de pesquisa e abordagens (Figura 1).

Protocolo

Todos os experimentos são realizados seguindo os protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso no College of William and Mary. Estágios de desenvolvimento referenciados neste protocolo estão de acordo com Nieuwkoop e Faber ^46.

1. Dissecação

1. Permitir que o meio de cultura celular e Cálcio Magnésio Médio Free (CMF) para equilibrar à temperatura ambiente. Você também vai precisar Modificado 0,1 X Marc Ringer (MMR) pH 7,4-7,6.
2. Esterilizar os seguintes itens, aplicando uma luz UV durante 30 min numa câmara de fluxo de células de cultura laminar. (Spray cada item com etanol 70%, antes de col....

Resultados

Exemplos de sucesso dissecados vesículas óticas (etapa 25) e retina (etapa 35) são mostrados nas Figuras 2E e 2J. Embora este protocolo pode ser utilizado em várias fases de desenvolvimento, é essencial para se obter apenas o tecido da retina para garantir a precisão para outras experiências. Remova cuidadosamente a epiderme em todas as etapas e garantir que seus fórceps não perfurar o tecido da retina. Na fase de 35 anos ou mais, a lente pode ser vista como uma camada transparente sobre a retina e pode.......

Discussão

Com os seus tipos de células bem caracterizadas que são conservados entre todos os vertebrados, a retina é um modelo útil para o estudo dos processos moleculares, celulares que regulam a especificação celular e diferenciação do tipo. Cultura celular primária proporciona um método poderoso para a investigação de uma grande variedade de processos, incluindo a expressão de genes, a dinâmica de proteínas, e de cálcio e actividade eléctrica no nível de resolução única célula. Aqui apresentamos uma técnica simples para a cult.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
			Para dissecções e cultura
BD Falcon fáceis de aderência de tecido placas de cultura, 35 mm	Pescador	08-772A
Pratos descartáveis ​​de Petri de poliestireno, 60 x 15 mm	Pescador	0875713A
35 milímetros Nunclon superfície pratos de Petri (com Airvent)	Pescador	12-565-91
Dumont Fina Fórceps (Dumostar # 55)	Pescador	NC9341917
Cellattice Micro-governado lamela de plástico, 25 mm	Pescador	50-313-17
Etil-m-aminobenzoato metanossulfonato de sal (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Sulfato de gentamicina	Enzo Ciências da Vida	380-003-G025
Gibco tripsina (1:250) Pó	Life Technologies	27250-018
Colagenase B a partir de Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
Sulfato Azul do Nilo (opcional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Sistema de Vácuo Garrafa filtro / Storage, de 0,22 Pore 33,2 centímetros Membrana CN 2	Corning	430758
			For Imaging Cálcio
Fluo-4 AM 1 mM em solução de DMSO, Cell Permanente	Life Technologies	F-14217
Solução de Pluronic F-127 a 10% em água	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Sistema de microscópio confocal	Zeiss	Modelo descontinuado
Bloqueio de Reagente	Roche	11096176001
			Para a hibridização fluorescente in situ (FISH)
Anti-digoxigenina-Pod, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3NHS éster	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamida desionizada,	Amresco	0606-950mL
Torula RNA, Tipo IX	Sigma-Aldrich	R3629
Sal de sódio da heparina, da mucosa intestinal suína	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Tabela 2. Reagentes específicos e de equipamento.
			Solução Referência Conteúdo Meio de Cultura de células Chang e Spitzer, 2009 54 116 mM de NaCl 0,67 mM de KCl 2 mM de CaCl 2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM Tris 1% (v: v) de Penicilina / Estreptomicina Ajustar o pH para 7,8 com HCl. Filtrar esterilizar por passagem através de um filtro de 0,22 um CN. Armazenar a 4 ° C. Cálcio-Magnésio Grátis Médio (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu e Spitzer, 1995 55 116 mM de NaCl 0,67 mM de KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) de Penicilina / Estreptomicina Ajustar o pH para 7,8 com HCl. Filtrar esterilizar por passagem através de um filtro de 0,22 um CN. Armazenar a 4 ° C. Tampão de ácido maleico (MAB) Sive et ai., 2000 53 100 mM de ácido maleico 150 mM NaCl (pH 7,5). Modificado Marc Ringer (MMR), 10X Sive et ai., 2000 53 100 mM de NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM de CaCl 2 5 mM de HEPES pH ajustado para 7,4 com NaOH 0,1 X MMR também contém 50 mg / ml de sulfato de gentamicina e o pH é ajustado para 7,4 com NaOH. Solução MEMFA, 10X Sive et ai., 2000 53 MOPS 0,1 M (pH 7,4) 2 mM de EGTA 1 mM MgSO4 Formaldeído 3,7% A solução 10X, sem formaldeido, pode ser armazenado a 4 ° C. O formaldeído é adicionado fresco (1/10 de volume de uma unidade padrão de 37%). Em tampão de hibridação in situ Sive et al., 2000 53 Formamida a 50% SSC 5X 1 mg / ml de ARN Torula 100 mg / ml de heparina Solução 1X Denhart de 0,1% de Tween 20 CHAPS a 0,1% 10 mM de EDTA. Soluções. * Gentamicina, um antibiótico, é usado em soluções de nossos MMR enquanto penicilina e estreptomicina são utilizados em meios de cultura nossos.