Artigo de método

Dissecção, Cultura, Análise e de

13.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/4377

⸱

23 de dezembro de 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Resumo

O processo pelo qual a região anterior da placa neural dá origem à retina de vertebrados continua a ser um dos principais focos da investigação clínica e básica. Para além da óbvia importância médica para compreender e tratar doenças da retina, o desenvolvimento da retina de vertebrados continua a funcionar como um sistema modelo importante e elegante para compreender a determinação de células neuronais do tipo e da diferenciação 1-16. A retina neural é composto por seis tipos de células discretas (gânglio, fotorreceptores amácrinas, horizontal, células bipolares e células gliais de Müller) dispostos em camadas estereotipados, um padrão que é largamente conservada entre todos os vertebrados 12,14-18.

Enquanto estudava a retina no embrião intacto desenvolvimento é claramente necessária para a compreensão de como este órgão complexo desenvolve a partir de uma saliência do cérebro anterior em uma estrutura de camadas, há muitas questões que beneficiam from empregando abordagens utilizando cultura de células primária de presumíveis células da retina 7,19-23. Por exemplo, analisando as células a partir de tecidos removidos e dissociados em diferentes fases permite discernir o estado da especificação de células individuais, em diferentes fases de desenvolvimento, isto é, o destino das células na ausência de interacções com os tecidos vizinhos 8,19-22 ,24-33. Cultura primária de células também permite que o investigador para tratar a cultura com os reagentes específicos e analisar os resultados de um nível da célula individual 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, um sistema modelo para o estudo clássico de desenvolvimento neural precoce 19,27,29,31-32,40-42, serve como um sistema particularmente adequado para a cultura de células da retina primário 10,38,43-45.

Tecido da retina presuntivo é acessível desde as primeiras fases de desenvolvimento, imediatamente após a indução neural 25,38,43. Além disso, dada ªem cada célula no embrião contém uma fonte de gema de ovo, as células da retina pode ser cultivada em um meio muito simples definidos que consistem de uma solução salina tamponada, eliminando assim os efeitos de confusão de incubação ou outros produtos à base de soro 10,24,44-45 .

No entanto, o isolamento do tecido da retina de tecidos circundantes e o processamento subsequente é um desafio. A seguir, apresentamos um processo para a dissecção e dissociação de células da retina em Xenopus laevis que serão utilizadas para preparar culturas de células primárias que, por sua vez, ser analisados ​​para a actividade de cálcio e a expressão do gene com a resolução de células simples. Embora o tema apresentado neste artigo é a análise de transientes de cálcio espontâneas, a técnica é amplamente aplicável a uma grande variedade de questões de pesquisa e abordagens (Figura 1).

Protocolo

Todos os experimentos são realizados seguindo os protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso no College of William and Mary. Estágios de desenvolvimento referenciados neste protocolo estão de acordo com Nieuwkoop e Faber 46.

1. Dissecação

  1. Permitir que o meio de cultura celular e Cálcio Magnésio Médio Free (CMF) para equilibrar à temperatura ambiente. Você também vai precisar Modificado 0,1 X Marc Ringer (MMR) pH 7,4-7,6.
  2. Esterilizar os seguintes itens, aplicando uma luz UV durante 30 min numa câmara de fluxo de células de cultura laminar. (Spray cada item com etanol 70%, antes de colocar na capa.)
    • 35 milímetros de plástico placas de Petri.
    • 60 milímetros de plástico placas de Petri.
    • 35 pratos de superfície milímetros Nunclon.
    • 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
    • p1000 micropipeta (1000 micropipeta ul).
    • Aerossol resistentes P1000 dicas (1.000 uL dicas de aerossóis micropipeta resistentes).
    • Álcoolcaneta resistente.
    • Fina dissecação fórceps.
    • * 15 ml tubos cônicos (apenas para a atividade de cálcio de imagem).
    • * Apenas para imagens de atividade do cálcio.
  3. Uma vez que a capa foi UV esterilizado e soluções têm atingir a temperatura ambiente, ligar a câmara de fluxo laminar na capa, spray para baixo luvas e garrafas de mídia com 70% de etanol e garrafas de mídia lugar no capô.
  4. No interior do capuz preparar o seguinte com uma micropipeta p1000 para cada placa de células, garantindo a rotulagem apropriada.
    • 60 milímetros uma placa de Petri de plástico contendo 10 ml de Meio de Cultura Celular - placa de dissecação.
    • Um prato de 35 milímetros superfície Nunclon contendo 2 ml de meio de cultura celular - Placa Cultura. (Pratos de plástico Nunclon não são ainda tratados com quaisquer colas.)
    • Um vazio de 1,5 ml de microcentrífuga tubo Explante-Tube dissociação.
    • * Um 15 ml cônico falcãotubo contendo 15 ml de meio de cultura celular. Para lavagem excesso Fluo4-AM, quando a atividade de cálcio imagem.
  5. Dentro do capô, preparar o seguinte com uma micropipeta p1000 para cada sessão de dissecção (mais de uma retina pode ser dissecada em uma sessão).
    • Um 35 milímetros de plástico placa de Petri contendo 2 ml CMF - Remoção Lavar Plate.
    • Um 35 milímetros de plástico placa de Petri contendo 2 ml CMF - Remoção Placa dissociação.
  6. Fora do capuz preparar o seguinte:
    • Uma placa de Petri 60 milímetros de plástico por placa de células contendo 10 ml 0,1 X MMR - Holding Plate.
    • Uma placa de Petri 60 milímetros de plástico por placa de células contendo 10 ml MMR 0,1 X - Placa Irmãos.
    • 60 milímetros uma placa de Petri de plástico por sessão de dissecação contendo 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml de MS-222 (tricaina) - Placa de anestesia.
  7. Adicionar 40 ul de tripsina de 5% na CMF à placa dissociação explante (resultando em uma solução de tripsina 0,1%), agite para misturar, e reserve.
  8. Se dissecar um embrião que é mais jovem do estágio 30, adicione 10 mg de colagenase B para a placa de dissecação (resultando em uma mg / ml de colagenase uma solução B), agite para dissolver e reserve.
  9. Seleccionar um embrião de fase desejado, a transferência para a placa de retenção, com uma pipeta de transferência não-estéril, e remover a membrana vitelina (se o embrião ainda não chocados), utilizando fórceps finos.
  10. Transferir várias identicamente encenado embriões para a Placa Sibling com uma pipeta de transferência não-estéril.
  11. Se o embrião é estágio 25 ou anterior, proceder directamente com a dissecação, de outra forma transferir o embrião para a Placa anestesiados com uma pipeta de transferência não-estéril e permitir que o embrião se sentar até movimento e resposta a estímulos cessa. Isso pode levaraté um minuto.
  12. Prossiga com dissecção (Figura 2) em um escopo de dissecação (objetivo 4X, ocular 10X).

Para a fase de embriões 25 anos ou menos:

  1. A transferência de embriões para a placa de dissecação com uma pipeta de transferência não-estéril.
  2. Utilizando dois pares de pinças finas, fazer um corte sagital mediano no lado ventral do embrião, a partir da extremidade posterior e continuando através do prensa de cimento na porção anterior do embrião.
  3. Abra cuidadosamente o embrião agarrando a borda do corte e espalhando a esquerda e direita. Isso resulta em um embrião com o lado dorsal voltada para dentro da placa de dissecação, e com a ectoderme ventrais espalhar aberta para revelar a endoderme e mesoderme dentro.
  4. Iniciar a remoção da endoderme e mesoderme (Figura 2A e 2B). A primeira camada e maior deste tecido é muito "fofo" com uma aparênciagrandes células e organização pouco óbvia.
  5. Depois de remover esta camada, o somitos e notocorda se tornará visível. Para um melhor contraste, mova o embrião a um prato de 60 milímetros separado Petri de plástico contendo 10 ml de meio de cultura celular e 100 ul de solução a 1% de sulfato de azul do Nilo (em água) durante 2-3 min antes da transferência de volta para a placa de dissecação. Isso vai manchar o ectoderma, somitos, e notocorda para facilitar a identificação e orientação.
  6. Concentrando-se na porção anterior do embrião, cuidadosamente remover a notocorda e mesoderme qualquer remanescente expondo o cérebro e as vesículas óticas (Fig. 2C).
  7. Uma vez que o cérebro e vesículas ópticas são completamente exposto, usar a pinça para cortar o tubo neural e ectoderme subjacente apenas posterior para o cérebro.
  8. Transformar esta parte (o cérebro e vesículas ópticas) de forma que a ectoderme está no topo.
  9. Tomando cuidado para não danificar as vesículas subjacentes óptica, cuidadosamente remover a ectoderme (Figura 2D).
  10. Finalmente, utilizando um fórceps, separar as vesículas ópticas a partir do cérebro (Figura 2D e 2E).

Para os embriões mais velhos do que estágio 25:

  1. Enquanto o embrião está na placa anestesiados, remover a porção ventral do embrião com um fórceps.
  2. Para um melhor contraste, mova o embrião para uma placa de Petri 60 milímetros de plástico contendo 10 ml de 0,1 X MMR e 100 uL de 1% de sulfato de azul do Nilo, durante 2-3 min antes de se transferir para a placa de dissecação. Isso vai manchar o azul ectoderma.
  3. Uma vez na placa de dissecação, puxe o ectoderma sobrejacente a retina (ou vesícula óptica para a etapa de embriões 26-30) (Figura 2F e 2G). Se Sulfato Azul do Nilo foi utilizado, a ectoderme será tingido de azul, mas o tecido subjacente retina não.
  4. Retire a retina ou vesícula óptica cuidadosamente com forceps (Figura 2H, 2I e 2J). É útil para manter o embrião no lugar com um par de pinças e retire a retina ou vesícula óptica com a outra.

2. Dissociação de tecidos e chapeamento de Células

Nota Importante - Ao transferir tecidos, não permitem a retina ou vesícula óptica para tocar todos os limites de ar-líquido, se isso ocorre, as células vão lise.

  1. Uma vez a vesícula óptica ou retina foi dissecado, transferir cuidadosamente para a explantação Lavar placa com uma micropipeta p100 utilizando pontas resistentes a aerossol e permitir a sentar-se durante 30 segundos.
  2. Transferir 80 uL de tripsina a 0,1% em CMF-se da placa de dissociação para a explantação Tubo Dissociation explante.
  3. Usando uma micropipeta, p100 e aerossóis pontas resistentes, transferir a retina ou vesícula óptica da explantação Lavar a placa Dissociati Explanteno tubo, evitando a transferência da solução de lavagem dos explantes.
  4. Permitir que o tecido se dissociar no Tubo A dissociação explante durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma retina foi utilizado por placa, no entanto, observar que é possível utilizar mais do que uma placa de per se assim for desejado aumentar o número de células por placa.
  5. A placa de células, em primeiro lugar lentamente remover 40 ul da solução a partir do Tubo de dissociação Explante e descartar utilizando uma micropipeta e p100 aerossol pontas resistentes. Usando um conjunto de p100 e 40 ul de aerossol pontas resistentes, transferir as células (agora que o tecido tenha dissociado) à placa de cultura. Quando a aspiração das células na placa, pipetar lentamente e manter as células em uma pequena área no centro do prato.

Nota: Se as imagens múltiplas de células devem ser tomadas ao longo da experiência, anexar uma grade (Cellattice) para o lado de baixo da placa de cultura forte, com uma pequena gota de super cola. Isto irá permitir que as imagens de células idênticas em orientações idênticas a serem tomadas em diferentes pontos do processo.

  1. Permitir que as células de se sentar sem ser perturbado por pelo menos 1 hora a aderir à placa Nunclon. Após este tempo, eles devem ser tratados com muito cuidado ou podem soltar-se.
  2. Células de cultura para a fase desejada pela observação dos embriões de irmãos, que são criados na mesma temperatura medida que as células. Se as células vivas não estão a ser utilizados para posterior manipulação, eles podem ser fixados em solução MEMFA neste momento.

Nota Importante: A maioria das nossas experiências são fixos dentro de 6 horas de plaqueamento das células. A longevidade das células em cultura é dependente da fase em que o tecido foi dissecada e a quantidade de gema ainda presente nas células, as células dissecadas a partir de menores (fases neurula) permanecem saudáveis ​​em cultura durante 5-6 dias, enquanto que as células adquirido embriões mais velhos (natação girinofases) irão permanecer viáveis ​​em cultura durante 2-3 dias.

3. Imagem de cálcio 47-49

Este protocolo utiliza o cálcio sensíveis Fluo4 microscopia confocal e-AM para quantificar transientes de cálcio em células individuais. Todos os passos usando Fluo4-AM deve ser realizada ao abrigo da luz, como Fluo4-AM é sensível à luz. Todas as lavagens devem ser adicionados ou removidos utilizando uma micropipeta e p1000 aerossol resistentes dicas. A pipetagem deve ser feito lentamente e no sentido do bordo da placa para evitar perturbar as células. A mídia não é alterada porque as culturas são geralmente fixados em até 6 h de ser dissecado. Para longo prazo culturas, a mídia deve ser trocada diariamente.

  1. Fluo4-AM é armazenado a -20 ° C, e sugere-armazenar em alíquotas de 5 ul. Antes de usar, descongelar uma alíquota de 5 ul de Fluo4-AM abrigo da luz e adicionar 2 ul de Pluronic F-127 directamente a esta alíquota.
  2. Após a cultura das células durante o período de tempo desejado (pelo menos1 h), retirar 1 ml do meio de cultura de células a partir da placa de cultura. Adicionar isto ao Fluo4-AM e Pluronic, misturando por pipetagem suave.
  3. Lentamente transferir toda esta solução de novo para a extremidade da placa de cultura das células a ser trabalhada e deixar que as células nesta solução em repouso durante 1 hora para absorver o Fluo4-AM.
  4. Para lavar o excesso de Fluo4-AM a partir do meio de cultura celular, completar a série de lavagem seguinte:
    • Remover 1 ml de meio da placa.
    • Adicionar 3 ml de meio de cultura fresco celulares (a partir do tubo cónico de 15 ml) à placa.
    • Executar duas lavagens adicionais, cada vez removendo lentamente 3 ml de solução a partir da placa e adicionar 3 ml de meio de cultura fresco de células.
  5. As células devem estar agora em 4 ml de meio de cultura de células e contêm Fluo4-AM. Fluo4-AM é enzimaticamente clivada, uma vez dentro da célula, impedindo-a de sair de difusão da célula ou em quaisquer compartimentos ligados a membranas.
  6. Antes de carregar a placa sobre a fase do microscópio confocal para imagiologia, desenhar uma linha vertical vermelho com marcador permanente no prato, mantendo a tampa para evitar que as partículas do marcador de contaminar a cultura. A linha vertical é desenhada para o lado da placa de Petri (à base do prato de Petri, e não a tampa). A sua finalidade é a de indicar a orientação da placa de cultura em relação ao campo de visão, de modo que a orientação precisa e alinhamento das células individuais podem ser re-estabelecido num ponto mais tarde.
  7. A placa está agora pronta para o carregamento no estágio do microscópio confocal para a imagiologia. Visualizar as células usando as configurações de campo brilhantes em um microscópio confocal de varredura a laser (objetiva 20X). Encontrar uma área de células densas, que não contém tufos, de preferência, com um campo de visão que contém os números de grelha grandes na lamela Cellatice para fazer encontrar o mesmo campo de visão mais fácil, mais tarde, quando a cultura de imagem depois de sihibridização tu. Antes da imagiologia, o foco para baixo através da cultura e dar uma imagem de campo brilhante da grelha abaixo das células para registar a localização e orientação da cultura celular. Isto permite que o realinhamento das células para análise posterior.
  8. Levantar o plano focal e capturar uma imagem de campo brilhante das células antes da imagiologia de cálcio começam (Figura 3A).
  9. Uma vez que o plano central das células está em foco, a placa está pronta para a imagiologia da actividade de cálcio. Configurações irão variar dependendo do microscópio e a aplicação. Nós imagem das células utilizando um laser de 488 nm de árgon, durante 1, 2 ou 12 horas com os seguintes parâmetros:
    • 1 hr imagens:
      • Laser de argônio 488 nm verifica a 4% de sua potência máxima de 30 mW.
      • Digitalizar uma vez a cada quatro segundos (900 scans por hora).
    • 2 imagens de RH:
      • Laser de argônio 488 nm verifica a 4% de sua potência máxima de 30 mW.
      • Digitalizar uma vez a cada8 seg (450 scans por hora).
    • 12 imagens de RH:
      • Laser de argônio 488 nm verifica menos 2% do seu poder máximo de 30 mW.
      • Digitalizar uma vez a cada segundo 48 (75 exames por hora).

Estes parâmetros irão resultar em um conjunto de 900 imagens fixas de quadro para cada intervalo de tempo. Actividade de cálcio pode então ser gravado através da análise de níveis de fluorescência ao longo do curso de tempo nas imagens (Figura 3B), com a utilização de uma aplicação de processamento de imagem, tais como ImageJ 50.

4. Fixação Células

  1. Na sequência de imagens, as células podem ser fixadas por 30 min, removendo 3 ml de solução a partir da placa e da adição de 1 ml de 2X MEMFA para o restante 1 ml de meio de cultura.
  2. Após a fixação, remover MEMFA e desidratar as células com uma série de cinco lavagens min cada, num volume de 1 ml:
    • 25% de etanol em 1X tampão de fosfato salino (PBS).
    • Etanol a 50% em PBS 1X.
    • 75% em sdd H 2 O (água desionizada destilada estéril).
    • Substituir a última lavagem com 1 ml de etanol a 100% e placa armazenar a -20 ° C.

Nota: O metanol pode também ser usado para estas lavagens e para armazenamento.

5. Hibridização in situ fluorescente (FISH)

As culturas podem ser analisadas utilizando o protocolo padrão de FISH para Xenopus como descrito 51, com modificações para a cultura de células, conforme descrito por Anderson na Lab 52. Modificações no Laboratório Anderson protocolo estão listadas abaixo. Todas as lavagens são realizadas nas placas de 35 mm de Nunclon volumes de cerca de 1 ml, a menos que indicado em contrário. As soluções são as definidas no Sive et al. 53, a menos que indicado em contrário.

Nota Importante: Não use fluoresceína marcados com sondas de RNA ao realizar hibridização in situ em células fotografada paraactividade de cálcio. Anticorpos anti-fluoresceína se ligará residual Fluo4-AM em células e pode provocar um sinal positivo em todas as células na cultura.

Dia 1: Permeabilização e Hibridação

  1. Lavagens de reidratação deve ser classificado para o solvente utilizado para a desidratação de armazenamento. Para as nossas experiências, as lavagens foram graduadas de etanol em 1X PBS.
  2. Na sequência de re-hidratação, lavagem das células três vezes adicionais em 1X PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
  3. Misturar 25 ml de trietanolamina 0,1 M (pH 8,0) com 62,5 ul de anidrido acético num tubo Falcon e rapidamente misturar até ficar bem disperso, como discutido no Laboratório Anderson 52 protocolo. Incubar as culturas nesta mistura durante 10 min à temperatura ambiente. Após o tratamento de anidrido acético, lava-se as células em solução salina de citrato de sódio 1X (SSC), durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Remover a solução de lavagem SSC último e substitua com HCl 0,2 M (em sdd H 2 O) durante 10 min para permeabilizar as células.
  5. Lavar a HCl com duas lavagens em 1X PBS durante 5 min.
  6. Prehybridize em tampão ISH a 60 ° C num banho de água com agitação durante um período mínimo de 6 horas, mas não durante a noite prehybridize como este diminui severamente sinal.
  7. Hibridizar durante a noite a 60 ° C durante 8-14 horas, em 750 ul de sonda diluída (1:250 de diluição a partir de uma sonda purificada). A intervalos de concentração de sonda purificado 1,0-1,5 ug / uL.

Dia 2: a remoção da sonda Unbound e Incubação de anticorpos

  1. Remover e lavar a sonda de culturas durante 5 min em 0,2 x SSC a 60 ° C. Lavar em 0,2 X SSC fresco durante 1 hr a 60 ° C.
  2. Remover as culturas a partir do banho de água e permitir-lhes ajustar a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Enxaguar em 0,2 X SSC à temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Lavar durante 15 min em 1X PBS com 0,1% de Triton-X-100 (PBT).
  5. Para inactivar peroxidases endógenas, lavar durante 1 hora em um 2% de H 2 O 2 em solução de PBT.
  6. Lavar com uma lavagem de 15 min em solução salina tamponada com Tris 1X com 0,1% de Tween 20 (TBST).
  7. Bloquear em 2% de reagente de bloqueio em tampão de ácido maleico (MAB), durante 1 hora à temperatura ambiente. Verificámos que este método de bloqueio aumenta a sensibilidade em relação aos anteriores métodos de bloqueio em 20% de soro de ovelha em PBT.
  8. Incubar as culturas em 1 mL de 2% de reagente de bloqueio em MAB contendo uma diluição 1:1.000 de um anticorpo POD-conjugado durante a noite a 4 ° C.

Dia 3: Remoção de anticorpo não e Desenvolvimento de fluorescência

  1. Remover a solução de anticorpos e lavar 3 vezes em TBST durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  2. Lavar 4 vezes em TBST durante 15 minutos à temperatura ambiente enquanto agitando continuamente a uma velocidade lenta.
  3. Lavar duas vezes em PBT à temperatura ambiente durante 10 min.
  4. Aplicar 750 ul de fluoresceína-tiramida 1:200 ou 1:25 Cy3 tiramida diluído em PBT. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e adicionar 2,5 ul de 0,3% de H 2 O 2. Agitar durante 40 minutos para permitir que o sinal para se desenvolver.
  5. Lavar, pelo menos, 4 vezes durante 15 minutos cada em TBST à temperatura ambiente com agitação.
  6. Uma vez que o sinal foi totalmente desenvolvido, lave durante 5 min em 1X PBT.
  7. Fixar em 1X MEMFA durante 1 hora à temperatura ambiente e armazenar em 1X PBS a 4 ° C.

6. Imagem Resultados peixes e Co-registo com dados de imagem de cálcio

  1. Após a conclusão de FISH, as placas de cultura de células são gravadas para determinar quais as células exibem um sinal positivo de fluorescência para uma dada sonda. Utilizar a lamela Cellattice para encontrar o campo de visão exacto estudado durante imagiologia de cálcio e alinhar a chapa para a orientação dos quadros de imagem de cálcio.
  2. Concentre-se ao plano do centro de células e dar uma imagem de alta resolução, só com o Hélio-Néon laser HeNe 543 nm a 15% da sua potência máxima mW 1 (Figura 3C).
  3. No quadro original de 900 conjunto de imagens tiradas a partir do protocolo de imagem de cálcio,identificar células individuais como as regiões de interesse (ROI), através da utilização de um programa de processamento de imagem (como ImageJ 50). Extrair dados de ROI fluorescência como um conjunto de pontos de dados que representam os valores de tempo de fluorescência par (Figura 4).
  4. Sobrepor a imagem FISH resultados com os ROIs identificados a partir das imagens de cálcio (Figura 3D).
  5. Registar cada ROI como positivo para a sonda, negativo para a sonda, ou desconhecidos - no caso de que a célula correspondente ao ROI já não pode ser encontrada dentro do campo de visão da imagem de FISH.
  6. Os dados do processo de ROI de fluorescência usando scripts de análise estatística (como projetado através MATLAB ou outra linguagem de programação) para comparar os níveis de atividade de cálcio entre os diferentes estágios dissecadas (Figura 5A e 5C) ou células positivas para sondas FISH diferentes (Figura 5B e 5D). Todos os scripts utilizados em nosso laboratório estão disponíveis gratuitamente, mediante solicitação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Exemplos de sucesso dissecados vesículas óticas (etapa 25) e retina (etapa 35) são mostrados nas Figuras 2E e 2J. Embora este protocolo pode ser utilizado em várias fases de desenvolvimento, é essencial para se obter apenas o tecido da retina para garantir a precisão para outras experiências. Remova cuidadosamente a epiderme em todas as etapas e garantir que seus fórceps não perfurar o tecido da retina. Na fase de 35 anos ou mais, a lente pode ser vista como uma camada transparente sobre a retina e pode...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Com os seus tipos de células bem caracterizadas que são conservados entre todos os vertebrados, a retina é um modelo útil para o estudo dos processos moleculares, celulares que regulam a especificação celular e diferenciação do tipo. Cultura celular primária proporciona um método poderoso para a investigação de uma grande variedade de processos, incluindo a expressão de genes, a dinâmica de proteínas, e de cálcio e actividade eléctrica no nível de resolução única célula. Aqui apresentamos uma técnica simples para a cult...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Nós graciosamente agradecer ao Dr. John Hayes para scripts; drs. Eric Bradley e Christopher Del Negro para a assistência com a microscopia confocal, de Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, e Liz MacMurray por seu trabalho no desenvolvimento do projeto e fornecer dados preliminares, o Dr. Greg Smith para sugestões úteis sobre a análise estatística. Este trabalho foi financiado por uma bolsa do NIH (NINDS IR15N5067566-01) para MSS e do Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant para o College of William and Mary.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
Para dissecções e cultura
BD Falcon fáceis de aderência de tecido placas de cultura, 35 mm Pescador 08-772A
Pratos descartáveis ​​de Petri de poliestireno, 60 x 15 mm Pescador 0875713A
35 milímetros Nunclon superfície pratos de Petri (com Airvent) Pescador 12-565-91
Dumont Fina Fórceps (Dumostar # 55) Pescador NC9341917
Cellattice Micro-governado lamela de plástico, 25 mm Pescador 50-313-17
Etil-m-aminobenzoato metanossulfonato de sal (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Sulfato de gentamicina Enzo Ciências da Vida 380-003-G025
Gibco tripsina (1:250) Pó Life Technologies 27250-018
Colagenase B a partir de Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicilina-Estreptomicina Gibco 15140-122
Sulfato Azul do Nilo (opcional) Pfaltz & Bauer N05550
500 ml Sistema de Vácuo Garrafa filtro / Storage, de 0,22 Pore 33,2 centímetros Membrana CN 2 Corning 430758
For Imaging Cálcio
Fluo-4 AM 1 mM em solução de DMSO, Cell Permanente Life Technologies F-14217
Solução de Pluronic F-127 a 10% em água Life Technologies P-6866
LSM 510 Sistema de microscópio confocal Zeiss Modelo descontinuado
Bloqueio de Reagente Roche 11096176001
Para a hibridização fluorescente in situ (FISH)
Anti-digoxigenina-Pod, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3NHS éster GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamida desionizada, Amresco 0606-950mL
Torula RNA, Tipo IX Sigma-Aldrich R3629
Sal de sódio da heparina, da mucosa intestinal suína Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Tabela 2. Reagentes específicos e de equipamento.

Solução Referência Conteúdo
Meio de Cultura de células Chang e Spitzer, 2009 54 116 mM de NaCl
0,67 mM de KCl
2 mM de CaCl 2
1,31 mM MgSO 4
4,6 mM Tris
1% (v: v) de Penicilina / Estreptomicina
Ajustar o pH para 7,8 com HCl.
Filtrar esterilizar por passagem através de um filtro de 0,22 um CN.
Armazenar a 4 ° C.
Cálcio-Magnésio Grátis Médio (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu e Spitzer, 1995 55 116 mM de NaCl
0,67 mM de KCl
4,6 mM Tris
0,4 mM EDTA
1% (v: v) de Penicilina / Estreptomicina
Ajustar o pH para 7,8 com HCl.
Filtrar esterilizar por passagem através de um filtro de 0,22 um CN.
Armazenar a 4 ° C.
Tampão de ácido maleico (MAB) Sive et ai., 2000 53 100 mM de ácido maleico
150 mM NaCl (pH 7,5).
Modificado Marc Ringer (MMR), 10X Sive et ai., 2000 53 100 mM de NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM de CaCl 2
5 mM de HEPES
pH ajustado para 7,4 com NaOH
0,1 X MMR também contém 50 mg / ml de sulfato de gentamicina e o pH é ajustado para 7,4 com NaOH.
Solução MEMFA, 10X Sive et ai., 2000 53 MOPS 0,1 M (pH 7,4)
2 mM de EGTA
1 mM MgSO4
Formaldeído 3,7%
A solução 10X, sem formaldeido, pode ser armazenado a 4 ° C. O formaldeído é adicionado fresco (1/10 de volume de uma unidade padrão de 37%).
Em tampão de hibridação in situ Sive et al., 2000 53 Formamida a 50%
SSC 5X
1 mg / ml de ARN Torula
100 mg / ml de heparina
Solução 1X Denhart de
0,1% de Tween 20
CHAPS a 0,1%
10 mM de EDTA.

Soluções. * Gentamicina, um antibiótico, é usado em soluções de nossos MMR enquanto penicilina e estreptomicina são utilizados em meios de cultura nossos.

Referências

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110(2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940(2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11(2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259(2011).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Tecido Retiniano de XenopusDisseca o RetinianaCultura de C lulas RetinianasImagem de C lcioMicroscopia ConfocalDissocia o TecidualCultura Prim ria de C lulasDesenvolvimento Embrion rioM todos de NeurobiologiaAn lise Celular

Artigos relacionados