O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Resumo

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de outros

Resumo

Superfícies mucosas, inclusive no trato gastrointestinal, urogenital e respiratória, fornecer portas de entrada para patógenos, como vírus e bactérias ^1. Mucosas são também locais indutivos no hospedeiro para gerar a imunidade contra os agentes patogénicos, tais como as manchas Peyers no tracto intestinal e do tecido nasal associada linforreticular no trato respiratório. Esta característica única traz a imunidade da mucosa como um jogador crucial do sistema de defesa do hospedeiro. Muitos estudos têm sido focados na gastrointestinais e respiratórias mucosas. No entanto, tem havido pouca investigação de reprodução mucosas. A mucosa do trato genital é o local da infecção primária de doenças sexualmente transmissíveis (DST), incluindo infecções bacterianas e virais. DSTs são um dos maiores desafios de saúde mais críticos que o mundo enfrenta hoje. Centros para Controle e Prevenção de Doenças estima que existem 19 milhões de novos a cada ano infecciosas nos Estados Unidos. STDs custar os EUA sistema de saúde 17000000000 dólares a cada ano ^2, e indivíduos de custos ainda mais em conseqüências imediatas e de saúde ao longo da vida. Para enfrentar este desafio, uma maior compreensão da imunidade da mucosa reprodutiva é necessária e isolar linfócitos é um componente essencial destes estudos. Aqui, apresentamos um método para isolar reproduzível linfócitos de murinos trato genital feminino para estudos imunológicos que podem ser modificados para adaptação a outras espécies. O método descrito a seguir é baseado em um rato.

Protocolo

1. A remoção do tracto genital

1. Euthanize o mouse utilizando as diretrizes aprovadas. Fazer incisão na linha baixa e retrair a pele.
2. Isolar e remover trato genital todo, do oviduto da abertura vaginal.
3. Abrir todo o trato longitudinalmente com uma tesoura.
4. Cortar o tracto genital com finas tesouras cirúrgicas em pequenos pedaços (cerca de <1 mm) numa placa de Petri com RPMI-10/EDTA completo (ver a fórmula seguinte) e agita-se o frasco de tecido em 125 ml à temperatura ambiente num agitador magnético definido para 15 min. Este procedimento é repetido duas vezes e, em seguida, o sobrenadante, que contém o epitélio e outros detritos, é descartada.
5. Despeje conteúdo do balão através de um filtro celular (40μm). Lavar resíduo EDTA com meio completo.
   RPMI/10 completo: RPMI 500 ml (Gibco), 10% de soro fetal bovino (FBS), inactivado pelo calor, 5 ml penicilina / estreptomicina, a 5 ml de HEPES 1M.
   RPMI-10/EDTA completo: RPMI a 10% (como acima) com E 5mMDTA

2. Digerir tecidos do trato genital

1. Transferir pedaços de tecido para um frasco novo, com 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (ver receita abaixo) e digerir o tecido, a 37 ° C durante 1 hora num agitador magnético definido para agitar vigorosamente o tecido.
   RPMI-10/collagenase completo: Pouco antes de utilização, reconstituir colagenase tipo VIII (Sigma; armazenar a -20 ° C, ou de acordo com as instruções do fabricante.), Adicionar em RPMI/10 completo até uma concentração final de 450-500U/ml.
2. Após a digestão em primeiro lugar, recolher os sobrenadantes através de 100 células coador um, manter as células em gelo.
3. Transferir o tecido não digerido para um novo frasco e repetir a etapa 2.1 por mais duas vezes, utilizando RPMI-10/collagenase completo fresco para um total de três digestões separadas. Neste ponto, há pedaços de tecido visível deve estar em solução.
4. Piscina os sobrenadantes todos juntos a partir de uma amostra e recolher a 100 filtro célula iM. Gire a cElls para baixo. Os sedimentos celulares irão ser separados usando gradientes de Percoll.

3. Separação de células do tracto genital, utilizando gradientes de Percoll

1. Preparar cada concentração de Percoll antes do uso:
   • 100% de Percoll isotônica: mix 09:01 estoque Percoll (Pharmacia Biotch) vs PBS 10x. pH a 7,4 com HCL.
   • Solução de Percoll a 40%: misturar 40 mL de Percoll isotónico 100% e 60 ml de meio RPMI completo.
   • Solução de Percoll a 70%: misturar 70 mL de Percoll isotónico 100%, com 30 ml de meio RPMI completo.
2. Ressuspender cada pelete de células a partir do passo 6 em soluções de Percoll 40%. Um volume igual de Percoll a 70% irá ser utilizado para fazer os gradientes. Há duas maneiras de configurar tubos de gradiente:
   1. Sob-camada: adicionar a suspensão de células com 40% de Percoll em um tubo de gradiente em primeiro lugar, em seguida, cuidadosamente sob-camada de Percoll 70%.
   2. Ao longo da camada de: adicionar Percoll a 70% num tubo de um lado, em seguida lenta e cuidadosamente carregar Percoll a 40%, contendo as células nasuperior.
3. Amostras de gradiente vai ser centrifugadas a 900 xg à temperatura ambiente, durante 20 minutos com o freio.
4. Os linfócitos será na camada de interface entre 40% e 70% de camadas Percoll. Cuidadosamente colher a camada de interface, lave com RPMI 1:3 e girar a 740 xg. Os linfócitos será no sedimento de células e estão prontos para utilização posterior.

4. Resultados representativos

Um exemplo de isolamento de linfócitos a partir do tracto genital rato e análise de citometria de fluxo (FACS) é mostrado na Figura 1. Tracto genital foi removido de Chlamydia muridarum intravaginalmente rato infectado 7 dias após a infecção. Duas vias genitais foram agrupados em conjunto de modo a ter um número suficiente de linfócitos exame funcional e fenotípica por FACS. Tecidos dissecados foram processados ​​pela digestão e passos de isolamento como descrito acima. A suspensão de células isoladas foram corados com vários conjugados com fluorocromosOs anticorpos monoclonais contra CD3 de ratinho, células T CD4 e CD8. A Figura 1 mostra uma apresentação dot-plot de CD4 células T positivas contra as células T CD8 positivas gated em linfócitos T CD3 positivas. Nosso procedimento pode examinar linfócitos isolados do trato genital de modelos de doenças diferentes para avaliar várias características de células imunes funcionais e fenotípica em diferentes doenças no modelo do rato. Estes incluem diversas células imunes, tais como células dendríticas, neutrófilos, macrófagos NK, NKT, células T (células T específicas Ag), células B, etc ^3-10.

Linfócitos Figura 1. Foram isolados a partir de trato genital de camundongos infectados com Chlamydia muridarum, utilizando o método aqui apresentado. Após o processo de separação completa, os linfócitos foram coradas com fluorocromo-conjugados CD3, CD4 e CD8. Os dados foram quadrante fechado em linfócitos CD3 +,mostrando CD4 + versus CD8 + com e porcentagem de células fechadas.

Discussão

Neste protocolo, é mostrado como preparar linfócitos no trato genital de mouse e é facilmente dominado. O ponto mais crítico deste processo é o de manter a viabilidade das células, mantendo as células em gelo. O rendimento de células a partir deste método depende da técnica, a manipulação de habilidade, o estado infeccioso do rato (ou ingénuo dia após a infecção), o agente patogénico (bacterianas, virais, fúngicas) e da secção do tracto reprodutivo murino examinados (oviduto, útero, segmento vaginal ou do trato genital ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome	Companhia	Número de catálogo
Colagenase	Sigma Ciências da Vida	C2139-1G
Percoll	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0891-01
RPMI1640	Gibco pela Life Technologies	11875