$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Inactivação funcional da expressão de genes em células de mamíferos é crucial para o estudo da contribuição de uma proteína de interesse a 1,2 caminhos diversos. No entanto, knockdown condicional da expressão do gene é necessária nos casos em que knockdown constitutivo não é tolerada pelas células durante um período longo de tempo 3-5. Aqui descrevemos um protocolo para a preparação de linhas de células que permitem knockdown condicional de subunidades do factor de remodelação da cromatina ACF. Estas linhas de células de facilitar a determinação da contribuição de ACF a indução da morte celular pela proteína E4orf4 de adenovirus 6. As sequências que codificam os ARN em gancho de cabelo curto para as subunidades Acf1 SNF2h e do factor de remodelação da cromatina ACF foram clonados ao lado de um promotor induzível por doxiciclina num plasmídeo que também contém um gene para o gene de resistência à neomicina. Clones de células resistentes à neomicina foram seleccionadas na presença de G418 e isolado. As linhas celulares resultantes foram induzidas pelatratamento doxiciclina, e uma vez que os níveis de expressão ou Acf1 SNF2h foram reduzidos, as células foram transfectadas com um plasmídeo codificando E4orf4 ou um vector vazio. Para confirmar o efeito específico dos construtos shRNA, os níveis de proteínas ou Acf1 SNF2h foram restaurados para os níveis WT por co-transfecção com um plasmídeo que expressa ou Acf1 SNF2h que foram tornadas resistentes ao shRNA pela introdução de mutações silenciosas. A capacidade de E4orf4 para induzir a morte das células nas diferentes amostras foi determinada por um ensaio de DAPI, em que a frequência de aparecimento de núcleos apoptóticos com morfologias, na população de células transfectadas foi medida 7-9.
O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para a determinação da contribuição funcional de várias proteínas para a indução da morte celular pelos seus parceiros de proteína nos casos em que pode ser constitutiva knockdown célula letal.