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Artigo de método

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em

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DOI:

10.3791/4443

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22 de dezembro de 2012

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1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory Caenorhabditis elegans. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.

Resumo

Durante a estimulação sustentada neurónios sensoriais mais irá adaptar a sua resposta, diminuindo a sua sensibilidade ao sinal. A resposta de adaptação ajuda a atenção forma e também protege as células de mais de estimulação. Adaptação no circuito olfativo de C. elegans foi descrita pela primeira vez por Colbert e Bargmann 1,2. Aqui, os autores definiram parâmetros do paradigma adaptação olfativa, que eles usaram para projetar uma tela de genética para isolar mutantes defectivos na sua capacidade de adaptação a odores voláteis sentidas pelas células Asa Amphid tipo C (AWC) neurônios sensoriais. Quando wildtype C. elegans animais são expostos a um odor atraente sentiu-AWC 3 para 30 min irão adaptar a sua capacidade de resposta ao odor e ignorará o odor a adaptar de um ensaio de quimiotaxia de comportamento de ~ 1 hora. Quando wildtype C. elegans animais estão expostos a um odor AWC-sentia atraente para ~ 1 hora então eles vão ignorar o odor adaptação em achemotaxis ensaio comportamental para ~ 3 hr. Estas duas fases de adaptação olfativa em C. elegans foram descritos como de curto prazo de adaptação olfactiva (induzida após 30 min de exposição odor), e a longo prazo de adaptação olfactiva (induzida após 60 min de exposição odor). Mais tarde, o trabalho de L'Etoile et al., 4 descoberto uma proteína quinase G (PKG) chamado EGL-4 que é necessário tanto para a adaptação a curto prazo e de longo prazo em neurônios olfativos AWC. A EGL-4 proteína contém uma sequência de localização nuclear que é necessário para respostas a longo prazo de adaptação olfativa, mas dispensáveis ​​para respostas de curto prazo de adaptação olfativa no 4 AWC. Ao marcar EGL-4 com uma proteína verde fluorescente, foi possível visualizar a localização da EGL-4 no AWC durante a exposição prolongada odor. Usando esta totalmente funcional GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula temos sido capazes de desenvolver um visor molecular de adaptação a longo prazo no olfactory 5 AWC. Usando este mleitura olecular de adaptação olfactiva temos sido capazes de realizar as duas telas para a frente e reverso genéticos para identificar os animais mutantes que exibem padrões defeituosos localização subcelular de GFP :: EGL-4 em 6,7 a AWC. Aqui descrevemos a: 1) a construção de GFP :: EGL-4 animais que expressam, 2) o protocolo para o cultivo de animais para os ensaios a longo prazo de translocação induzida odor nuclear, e 3) a pontuação do odor a longo prazo induzida evento de translocação nuclear e recuperação (re-sensibilização) da GFP nuclear :: EGL-4 estado.

Protocolo

1. Construção de GFP Tagged EGL-4 Animais Expressando

  1. Clonar o traducional fusão GFP :: EGL-4 sob o promotor para o gene odr-3 (2678 pb utilização directamente a montante do codão de iniciação): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. A expressão ODR-3 unidades promotoras nos pares de neurônios amphid: AWA, AWB; AWC, e fracamente em ASH.
  2. Injectar o plasmídeo (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 do tipo selvagem (em N2) animais aos 50 ng / ul com os marcadores de co-injecção, utilizando técnicas padrão de transformação de linha de germe 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / uL), e (p) odr-1 :: DsRed 10 (25 ng / ul). O promotor odr-1 expressão unidades no AWC e pares AWB amphid neurônio, eo ofm-1 promotor expressão unidades nos coelomocytes.
  3. Submeter os animais transgénicos que expressam os arrays extracromossómicos detalhados no Passo 1.2 para a Ultra Violeta (UV) / trimetilpsoraleno (TMP) protocolo de integração11.
  4. Bleach sincronizar os 12 animais e cultivá-las em Nematóides de crescimento Media (NGM) placas contendo OP50 E. coli para a fase de L4. Lave L4 animais fora das placas NGM com tampão M9 para remover OP50 E. coli.
  5. Remover o tampão M9 e adicionar 50-100 ul de 30 ug / ml de solução de trabalho de TMP para o sem-fim pellet no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Enrole a 1,5 ml em tubos de microcentrífuga de folha para bloquear a luz ambiente, e agitar suavemente num agitador rotativo durante 15 min na folha embrulhado tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfira os vermes na solução de TMP / worm para uma placa NGM grande unseeded.
  6. Expor os vermes na placa NGM de UV 350 μJ (X100), utilizando um Stratalinker 2400. Em seguida, adicionar a uma placa de vermes NGM contendo OP50 e incubar no escuro durante 5 horas.
  7. Escolha 50 vermes transgênicos para cerca de 10 placas semeadas (2-5 vermes cada placa). Transferência P0 é a placas novas a cada 24 horas durante 3 dias.
  8. Escolha 250 F1 clonal umnimals (1 animal por placa). Clonar animais F2 2-4 fora de cada placa F1. Verifique animais F3 para procurar uma linha de transmissão de 100% olhando (p) ofm-1 :: GFP padrão de expressão sob um microscópio de dissecação fluorescente.
  9. Outcross a linha final integrado (s) com os animais de tipo selvagem N2 5 vezes. Vamos remeter para a linha final integrada como pyIs500, eo GFP-tagged EGL-4 molécula como GFP :: EGL-4.

2. Cultivo e Manutenção de Animais para Ensaios translocação nuclear

  1. Cultivar as pyIs500 animais a 25 ° C em placas de 10 cm padrão NGM (ver abaixo para receita) semeado com E. OP50 coli 13 (Figura 1).
  2. No dia 1, escolher 4-5 L4 pyIs500 animais de placas cultivadas a 25 ° C para cinco separados 10 centímetros OP50 E. coli semeadas placas e incubar a 25 ° C (isto é, L4 4-5 animais por placa).
  3. No dia 4, lavar adulto populations de pyIs500 animais fora das placas NGM grandes usando S-Basal tampão (veja abaixo a receita). Usar pipetas de vidro descartáveis ​​para transferência dos animais, como eles vão ficar ao lado de ponteiras plásticas.

3. Longo prazo Odor Induzida nucleares ensaios de translocação

  1. Lavar os pyIs500 animais 3 vezes em S-Basal para remover as bactérias. Não centrifugar animais entre as lavagens, mas sim que os animais possam resolver por gravidade em um tubo de microcentrífuga estacionário de 1,5 ml. É crítico para assegurar que todas as bactérias é removido, e que pates NGM estão livres de contaminação, como bactérias residuais irá afectar negativamente o resultado do ensaio de translocação. Além disso, descobrimos que a autoclavagem os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga produz uma propriedade "pegajosa" nas paredes interiores do tubo que faz com que animais de ficar para os lados, e assim usar não autoclavados 1,5 microtubos ml.
  2. Enquanto os animais estão se instalando entre as lavagens, fazer-se tele adaptação solução. Adicionam-se 100 ml de S-tampão basal para se formar um cilindro de 100 ml. Adicionar adaptando odor para o S-basal e selar o cilindro usando uma tira de Parafilm. Se se realizarem adaptação benzaldeído adicionar 7,5 ul de benzaldeído em 100 ml de S-basal, para adaptação butanona adicionar 11 ul de 2-butaone a 100 ml de S-basal. Inverta suavemente (não agite) o cilindro de se formar contendo S basais e odor 30 vezes para criar uma emulsão uniforme.
  3. Após a lavagem final de S-basal, que os animais possam assentar e remover todo o líquido. Rotular um tubo "+ ve" ou "adaptar" e o outro tubo "ve-" ou "unadapt". Em seguida, adicionar 1 ml da mistura de adaptação ao tubo de microcentrífuga de adaptação (+ ve) e adicionar 1 ml de S-Basal ao tubo de microcentrífuga unadapted controle (-ve). Tente para manter o número de animais entre 100 e 200 em cada um dos tubos. Com alguma prática, é possível estimar a quantidade aproximada de animais de um pellet por olho.
  4. Coloque um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga tampa protetoraa cada tubo (impede as tampas de abertura de estalo) e colocar os tubos num rotor durante 80 min. Nós descobrimos que a exposição odor entre 60 min e 80 min produz resultados semelhantes (ambos resultam em respostas de adaptação a longo prazo). No entanto, 80 minutos de exposição fornece resultados mais consistentes em nossas mãos. Assim, todos os nossos ensaios a longo prazo são padronizados de adaptação usando uma exposição de 80 min odor (fig. 2).
  5. Após 80 min, lava-se 3 vezes em animais de S-basal. Permitir que os animais se contentar por gravidade entre cada lavagem.

4. Curto prazo Odor-nucleares induzidas ensaios de translocação

  1. No caso de curto-prazo adaptação odor, usar o mesmo protocolo como a longo prazo por ensaios de translocação odor induzidas (Passos 3,1-3,4), no entanto, em vez de incubação dos animais na adaptação pyIs500 odor por 80 min, utilizar uma exposição de 30 min . A quantificação do odor induzidas ensaios de translocação nuclear descritas abaixo (Passo 5) é o mesmo para a longo prazo e curto-tuloexposições m.

5. Marcando o Odor induzido evento de translocação nuclear

  1. Fazer almofadas de agarose a 2% contendo 5 mM de azida de sódio (NaN3) por dissolução de electroforese em gel de agarose em dH 2 0. Colocar uma única gota de agarose fundida contendo NaN 3 em uma lâmina de vidro de microscópio. Colocar imediatamente uma outra lâmina de microscópio de vidro sobre a primeira lâmina para achatar a gota de agarose fundida. Deixar durante 30 segundos, e então suavemente desmembrar o microscópio desliza deixando uma lâmina de microscópio com uma almofada de agarose plana de ~ 1 mm.
  2. Após a lavagem final de S-basal, permitir que os vermes se estabelecer no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover todo o líquido. Em seguida, adicione os animais gota a gota sobre as almofadas de agarose de várias lâminas de microscópio. É importante manter o número de animais por slide para entre 50 e 100. Muitos animais por slide irá complicar pontuação e muitas vezes criar um brilho dispersando depois azul-luz de excitação. O excesso de líquido podeser mau a partir do bloco de agarose através de um pequeno Kim-wipe. Colocar um vidro de 0,5 milímetros tampa deslize para a almofada e deixar em repouso durante 2 min para permitir a NaN 3 a imobilizar os animais. Nota, os animais podem ser recuperados a partir das lâminas, depois de pontuação. Os animais recuperar da anestesia depois NaN 3 ~ h 1 se transferido para uma placa de NGM semeado em uma gota de tampão M9.
  3. Neste ponto, é imperativo que cada experimentador conceber uma chave para controlar quais slide é o slide (+ ve) experimental e que deslizam é ​​o controle (-ve) slide, e passar os slides para outra pessoa que irá cegamente marcar o GFP: EGL-4 padrão de localização. Isto vai controlar a qualquer enviesamento experimentador.
  4. Pontuação entre 50 e 100 animais por slide usando um microscópio vertical fluorescente com objetivos de ampliação de 10x, 40x e 63X e GFP / RFP filtros. Em primeiro lugar, localizar animais com a ampliação de 10X usando brilhante-campo de iluminação. Em segundo lugar, localizar o neurônio AWC desligando o bright-campo de iluminação e de utilização do filtro de RFP. Os (p) odr-1 :: unidades DsRed expressão em AWB e neurônios AWC. Os neurónios têm AWC distintivas ovais em forma de corpos celulares, em comparação com os corpos celulares AWB que são mais pequenos e de forma circular (Figura 2).
  5. Uma vez que o corpo celular AWC foi localizado, mude para o filtro GFP e registrar a localização de GFP: EGL-4 como nuclear ou citoplasmática. Usando um contador permite o experimentador para manter olhando para o ocular ao marcar o slide. Nota: 5,1-5,5 passos são repetidos pelo menos 3 vezes em dias diferentes para produzir resultados estatisticamente significativos (Figuras 1-2).

6. Monitoramento GFP-tagged EGL-4 durante a recuperação de adaptação a longo prazo Odor

  1. Após o passo 3.5, dividir as populações de animais pyIs500 em alíquotas múltiplas e pontuação para GFP nuclear contra citoplasmática :: EGL-4 no CTA no ponto zero de tempo (isto é, após 80 min de exposição) e mpontos ultiple subsequentes de tempo (Figura 3).
  2. Transferir tanto o controlo (-ve) e experimental (+ ve) animais usando pipetas de vidro descartáveis ​​em placas NGM.
  3. Permitir que os animais recuperassem durante vários períodos de tempo e re-examinar a localização de GFP :: EGL-4in AWC em cada ponto de tempo como nos Passos 5,1-5,5.

7. Materiais

Placas NGM: Para adicionar a 1 L 1 L DDH 2 0: 21 g de Bacto-Agar, 3 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,5 g de Bacto-peptona. Mídia autoclave. Depois de agar autoclavagem, o frio até a temperatura lê 54 ° C. Adicionar as soluções seguintes: 25 ml de tampão de fosfato de potássio 1M; 1 ml 1 M de sulfato de magnésio (MgSO 4), 1 ml de cloreto de cálcio 1 M (CaCl 2), 1 ml de colesterol em etanol (5 estoque mg / ml).

1 M Dibásico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Por 500 ml: Em 400 ml de DDQ 2 O, dissolver 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Ajuste o volume para 500 L com DDH 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter.

Monobásico 1 M KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Para 1 litro: Em 800 ml de DDQ 2 O, dissolver 136,1 g monobásico KH 2 PO 4. Ajustar o volume a 1 litro com DDQ 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter.

1 M fosfato de potássio (K 3 PO 4), pH 6,0, tampão: Para 1 litro: Em uma unidade estéril de 1 L Filtro, adicionar 868 ml de 1 M monobásico KH 2 PO 4. Permita que a unidade para filtrar, em seguida, adicionar 132 ml de 1 M Dibásico K 2 HPO 4. Permita que a unidade para filtrar todo o líquido. Remover unidade de filtro e ajustar o pH a 6,0. Armazenar à temperatura ambiente.

S-basal: para 1 L: adicione 50 ml 1M K 3 PO 4 Buffer, pH ~ 6,0 e 20 ml de NaCl 5M aq. Encha até 1 L comDDH 2 O. Autoclavar Solution.

M9: Para 1 litro: 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O. Encha até 1 L com DDQ 2 0. Esterilizar em autoclave.

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Resultados

Um exemplo do padrão de localização da GFP :: EGL-4in a CTA, antes e após exposição prolongada odor é mostrado na Figura 2. Antes da exposição prolongada odor, GFP :: EGL-4 está localizada no citosol da CTA (Figura 2B), e após 80 min de exposição odor GFP :: EGL-4 é localizada para o núcleo da CTA (Figura 2D). No nível comportamental, os animais com citosólica GFP :: EGL-4 em AWC são atraídas para uma fonte pontual de odor (Figura 2C representa graficam...

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Discussão

A entrada odor induzida nuclear de um GFP-tagged EGL-4 molécula aqui descrita proporciona uma leitura robusto molecular de adaptação olfactiva em C. elegans. O odor induzidas ensaios de translocação nuclear são simples e requerem apenas alguns dias de tempo de preparação. O animal pyIs500 que construímos para estes ensaios, expressa um marcador, que ilumina o neurónio AWC, bem como a expressão da GFP-tagged proteína EGL-4. Assim, sentimos que um experimentador com pouca ou nenhuma experiência de trabal...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Scott Hamilton, e membros do laboratório O'Halloran para a leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também o nosso revisor anônimo pelos excelentes sugestões e comentários perspicazes.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Agar Bacto Difco DF0140-07-4 Placas NGM
Cloreto de Sódio Fisher Chemical S671-10 Placas NGM
Bacto Peptona Difco DF0118-07-2 Placas NGM
Fosfato de Potássio Dibásico Fisher Chemical S375-500 S-tampão basal e NGM placas
Fosfato de potássio monobásico Fisher Chemical P285-500 S-tampão basal e NGM placas
Kimwipes - Pequeno Kimberly-Clark LS2770
Etanol a 100% Escudo de ouro QuímicaCo. 43196-115 odores diluição para os ensaios de quimiotaxia
Cloreto de cálcio Sigma-Aldrich C8106-500G Placas NGM
Sulfato de Magnésio Biomedicals MP 150136-500G Placas NGM
Azida de sódio 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anestésico
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose almofadas
Benzaldeído Sigma-Aldrich B1334-100G Odor AWC
Butanona, ACS grau Sigma-Aldrich 360.473-500ML Odor AWC
Microtubos - 1,5 ml coloridas Denville LS8147
Pipeta Pasteur 5-3/4 copo descartável " Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 Integração UV
Garrafa de vácuo Filter - 500 ml Nalgene 09-740-25B

Referências

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