Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Resumo

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Resumo

Mapas de destino, construídos a partir da linhagem de rastreamento de todas as células de um embrião, revelam que os tecidos descendem de cada célula do embrião. Embora os mapas destino são muito úteis para a identificação de precursores de um órgão e para elucidar o caminho de desenvolvimento pelo qual as células descendentes povoar o órgão do embrião normal, não ilustram o potencial de desenvolvimento de uma célula precursora ou identificar os mecanismos pelos quais seu destino é determinado. Para testar compromisso destino da célula, se compara repertório normal de uma célula de descendentes no embrião intacto (o mapa destino) com os indicados depois de uma manipulação experimental. É o destino da célula fixo (comprometido), independentemente do meio ambiente celular, ou é influenciada por fatores externos prestados por seus vizinhos? Usando os mapas destino abrangentes do embrião de Xenopus, descrevemos como identificar, isolar e cultura precursores de estágio único de clivagem, chamado Blastomeres. Esta abordagem permite avaliar se estas células iniciais estão comprometidos com o destino que elas adquirem no seu meio ambiente normal em que o embrião intacto, requerem interacções com as suas células vizinhas, ou pode ser influenciada para expressar destinos alternativos, se forem expostos a outros tipos de sinais.

Introdução

Embriões de Xenopus laevis foram utilizados extensivamente para identificar os mecanismos pelos quais as células embrionárias adquirem os seus destinos específicos, porque os ovos são suficientemente grandes para permitir que as abordagens de microcirurgia. Além disso, desenvolvem-se externamente, sem a necessidade de suplementação nutricional do meio de cultura uma vez que cada célula contém uma fonte rica intracelular de plaquetas gema que proporcionam um armazenamento de energia intrínseca. Um trunfo importante para o estudo dos mecanismos pelos quais o destino da célula é determinado é o conjunto completo de mapas destino dos blastômeros estágio de cliva....

Protocolo

1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos

1. Afie quatro pinças utilizando filme abrasivo Alumina. Fazer isso sob um microscópio de dissecação para monitorar o tamanho da ponta. Um par de fórceps serve como um back-up no caso de uma dica é danificado durante o procedimento. Autoclave as quatro pinças e armazenar em um recipiente estéril.
2. Faça 500 ml cada de meio de cultura 0,1 X 1,0 X e (ou Modificação de Marc Ringers [MMR] ou salinos Modificado Barth [MBS]; receitas em ¹⁵⁾ e filtro de esterilizar. Rotineiramente utilizar MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM _CaCl2, 1 mM _MgSO4, HEPES 5 mM [pH 7,8],....

Resultados

A capacidade deste ensaio para avaliar com precisão a potencial de desenvolvimento das células baseia-se dissecando a blastômero correcta com base no destino de mapas ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Portanto, é importante escolher os embriões com o padrão de pigmentação correcta na fase 2-célula, como se ilustra na Figura 1, que, posteriormente, em conformidade com padrões de clivagem regulares, conforme ilustrado na Figura 2. Se uma observa os embriões classificadas como chegar ao estágio.......

Discussão

Os passos mais críticos para a cultura bem sucedida de blastômeros individuais são os seguintes: 1) identificar correctamente o blastômero de interesse e 2) manutenção de uma cultura estéril e saudável, 3) as células de dissecação na parte correcta do ciclo celular, e 4) o desenvolvimento do Manual necessário destreza para evitar danos durante a dissecção e transferir para a cultura também.

Para manipular blastómeros específicos, é essencial ser capaz de identificar os eixos cardinais. Em em.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Filme abrasivo de alumina	Thomas Scientific	# 6775E-38	Curso (12 mm), para grandes reparações de dicas fórceps
Filme abrasivo de alumina	Thomas Scientific	# 6775E-46	Médio (3 mm), para a multa afiação de dicas fórceps
Filme abrasivo de alumina	Thomas Scientific	# 6775E-54	Fina (0,3 mm), para o polimento de dicas fórceps
Fórceps: Dumont, Dumoxel Biologie # 5	Belas Science Tools	# 11252-30	Estes têm as pontas finas que não precisam de afiar quando comprado. Resistente à corrosão para que eles possamser autoclavados.
Solução de gentamicina	Sigma	G1397	Adicionar ao meio no mesmo dia que a utilização