$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
* Todos os materiais, juntamente com respectivos fabricantes e / ou fornecedores estão listados a seguir o protocolo.
1. Assembleia de Implante
- Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica através da adição de 100 mg de endurecedor a 1 g de resina.
- Medir e cortar aproximadamente 35 mm de 125 fibra óptica com 100 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto cunha ponta. Posicione o escriba perpendicular à fibra óptica e pontuação em um movimento único unidirecional. Cortando a fibra completamente irá danificar o núcleo da fibra.
- Insira uma cerâmica LC ponteira com um 127 mM levavam para o vice, lado convexo apontou para baixo.
- Insira o de fibra óptica no ponteira. A fibra óptica deve deslizar suavemente e marginalmente se projetam além do final convexa da ponteira (Figura 1a).
- Aplique uma gota de calor curável epóxi fibra óptica para a extremidade plana e calor com a arma de fogo até epóxi fica preta. O epóxi deveencher a virola como ele é aquecido e antes da cura. O epóxi deve curar dentro de ~ 1 min de aplicação de calor constante.
- Limpar qualquer epoxi ao longo dos lados da manga, uma vez que irá dificultar a interface com o acoplador.
- Polir a extremidade convexa da virola com um disco de polimento LC fibra óptica (FOPD) em folhas de alumínio óxido de polimento sobre a almofada de polimento (Figura 1b). Fazer padrões circulares de rotação e polonês em quatro graus, na seguinte ordem: 5, 3, 1 grão mM 0,3.
- Cortar a fibra óptica na extremidade plana com o comprimento adequado de tal forma que tem como alvo a região de interesse. O comprimento pode ser determinado utilizando o atlas estereotáxico.
- Testar o implante, ligando-a a laser, através do cabo de acoplamento descrito abaixo. A extremidade polida do implante é inserido na manga do dispositivo de acoplamento e deve entrar directamente em contacto com a virola de oposição. O implante deve ser capaz de manter a 10 mW de saída de luz, medida na extremidade do thfibra implante e. Um implante mau terá um ponto fraco focal próximo da ponta da fibra óptica.
- Armazenar os implantes acabados (Figura 1c) de espuma, até utilização.
2. Assembleia de Cabo Acoplador de fibra óptica
- Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica como descrito acima.
- Meça e corte um comprimento adequado de 220 fibra óptica com 200 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto de cunha ponta. O comprimento da fibra deve permitir que o rato se mover livremente em torno da caixa, mas não permitem que o rato para mastigar através da fibra.
- Inserir a fibra óptica para um comprimento de tubagem de furca ligeiramente mais longo do que o comprimento da fibra óptica. O tubo deve ter um diâmetro interior ligeiramente maior do que a da fibra óptica.
- Faixa ~ 25mm em uma das extremidades da fibra óptica e inseri-la na extremidade de metal de um MM FC Multimode virola Assembly com 230 uM furo até que pare. A fibra óptica deve ficar fora através da ferrule final (Figura 2a).
- Assegurar a ligação com o cianoacrilato (super-cola) na extremidade de metal. Cubra a conexão com um conector de inicialização e polir a final com uma ponteira FOPD FC. Fazer padrões circulares de rotação e polimento em quatro graus na seguinte ordem: 5, 3, 1, 0,3 mM grão (Figura 2b).
- Tira e insira a outra extremidade da fibra óptica para uma cerâmica LC virola (230 uM ID furo) com a extremidade distal convexa. Aplicar uma gota de epóxido para a extremidade plana e calor até a cura.
- Polir a extremidade convexa da virola com um FOPD FC em folhas de alumínio óxido de polimento como descrito acima.
- Deslizar a manga LC virola sobre a extremidade convexa do casquilho até ao ponto médio da manga.
- Lugar tubo termorretráctil sobre o tubo de bifurcação e manga e calor para fixar e proteger a ligação (Figura 2c).
- Testar o acoplador, ligando-a à fonte de laser e de medição da luz output através do acoplador com um espectrofotómetro. A perda de luz entre a saída do laser e o acoplador de saída medido não deve exceder 30%.
3. Implantação cirúrgica
* Este é um procedimento pontas apenas. Instrumentos são estéreis mas as luvas não precisam ser devido a manipulação constante entre os instrumentos e equipamentos.
- Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal mistura ketamina / xilazina 100 e 10 mg / kg, respectivamente, utilizando uma agulha de calibre 30.
- Raspar o couro cabeludo com clippers. Limpar o couro cabeludo, com 70% de álcool isopropílico seguida de Betasept limpar (solução de clorexidina a 4%) durante dois minutos, repetindo-se uma vez.
- Posicione o mouse na plataforma sterotaxic e proteger a cabeça, garantindo que o crânio é de nível. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e dor pós-operatória. Manter a anestesia usando% isoflurano (1-3 volatilizados diluído com o oxigênio, dependendo do estado fisiológico do mouse, o qual deve ser continuamente monitorizado por resposta a uma pitada de cauda).
- Fazer uma incisão pela linha média do couro cabeludo, expondo o crânio das órbitas oculares de lambda. Afastar do tecido conjuntivo, como necessário.
- Use grampos Serafin para segurar a pele e manter um acesso ao crânio (Figura 3a).
- Um padrão quadriculado Etch toda a superfície do crânio com uma palheta dental. Lave os detritos com uma solução salina estéril. Seque bem.
- Aplicar o peróxido de hidrogénio (3%) ao crânio exposta com uma mecha de algodão para ~ 2-3 segundos para criar microporos. Lave várias vezes e seque bem. Alternativamente, as âncoras pode ser aparafusado na cavidade craniana, como descrito em Sparta et al. (2012).
- Novamente, um padrão xadrez etch todo o crânio com uma picareta dental e lavar os detritos com solução salina. Seque bem.
- Usando uma ferramenta rotativa, fazer um pequeno orifício de trepanação craniotomia (<1 mm de diâmetro) com uma broca estéril(Autoclavado) acima da região de interesse, determinada pelo atlas estereotáxico calibrado para bregma e lambda. Tenha cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido. Lave e seque bem os detritos.
- Insira a ponteira de fibra óptica (implante) para o suporte da sonda e ligar para o braço estereotáxico.
- Posicionar o implante no local directamente acima da região de interesse, utilizando o braço estereotáxico (Figura 3b). Se a inserção da fibra óptica no tecido cerebral, a fibra deve ser avançada lentamente, a uma taxa de ~ 2 mm / min. A ponteira deve descansar no crânio restante.
- Prepara-se uma mistura de cimento dentário. A mistura deve ter uma viscosidade suficientemente baixa para aplicar facilmente através do crânio. Mistura será utilizável para 2-4 min.
- Utilizando um palito estéril, aplicar uma camada fina e uniforme de cimento dentário através do crânio e para a porção inferior do implante. A camada de base de cimento dental deve cobrir área de superfície, tanto no crânio comopossível. Não deixe que o cimento dental entrar em contacto com a pele do rato. Isto levará a dificuldade acrescida de sutura, bem como irritação para o rato. Se o cimento dental não entrar em contacto com a pele, permitir a secar parcialmente de tal forma que toda a camada de cimento pode ser retirada antes do ajuste.
- Deixe-a secar completamente.
- Aplicar até mesmo camadas de cimento dentário para formar um pequeno monte por cima do crânio e em torno do implante, permitindo que cada camada secar completamente (Figura 3c). Deixar ~ 3-5 mm da extremidade convexa da ponteira limpa de cimento para permitir uma ligação suave e desobstruído.
- Suturar o couro cabeludo sobre o monte de cimento dentário e em torno do implante usando suturas estéreis, de uso único de seda entrançada (6-0) com uma agulha de C22. Remover após 7 dias. Opcional: Bond Vet Uso para ligação adicional após a sutura. Certifique-se de usar de Bond Vet mínimo. O excesso pode levar a danos na pele graves devido a arranhões.
- Immediately após a cirurgia, o rato deve ser injectado por via subcutânea com Ketprophen (5 mg / kg) para diminuir a dor no pós-operatório. Isto deve ser repetido 24 horas depois. Aplicar analgésicos tópicos (Bupivicaine) e antibióticos (Neosporin) para a pele suturada e em torno da base do implante.
- Posicione o mouse em uma gaiola sobre uma manta de aquecimento para a recuperação da anestesia. Posicione o mouse em uma gaiola estéril, recuperação pós-operatória. A gaiola de recuperação não deve conter qualquer cama a fim de manter a temperatura e evitar a asfixia. O rato pode ser devolvida à gaiola original ou uma nova gaiola uma vez acordado.
Montagem adequada do implante de fibra óptica e os resultados do acoplador na perda de fotões mínima entre a fonte de luz e a extremidade da fibra óptica na região de interesse. Ótica bem polidas fibra devem transmitir a luz em um uniforme, círculo concêntrico (Figura 2d). Com a implantação cuidadosa e sutura, o implante não causa irritação visívelo rato e pode permanecer no lugar por estudos de longo prazo (Figura 3D,> 1 mês, observações não publicadas), sem qualquer degradação significativa da fibra óptica ou da quantidade de luz transmitida. Implantação inadequada ou sutura pode causar irritação e pode resultar no rato arranhões através do seu couro cabeludo, expondo o cimento dentário, ou quebra da ponteira do cimento dental devido à manipulação persistente. Um diagrama esquemático do sistema montado pode ser visto na Figura 4.
Figura 1. Assembleia da fibra óptica implantáveis. (A) A fibra óptica é inserido na manga, ligeiramente saliente para além da extremidade convexa indicada pela seta. (B) A extremidade convexa da virola é polida utilizando um FOPD em graus progressivamente mais finos de folhas de polimento. (C) O opt fibra acabado implantávelIC. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Montagem do acoplador de fibra óptica utilizado para amarrar o conjunto rotativo de fibra óptica para o implante. (A) a aderência fibra óptica através do conjunto ponteira. (B) O lado da virola do conjunto é inserido nos graus FOPD e polidas usando progressivamente mais finas de papel de lustro. (C) A manga ponteira é colocada sobre a manga e fixada com um tubo de retracção térmica. (D) O acoplador de fibra óptica deve terminar produzem uma luz concêntrico com perda mínima de fotões.
Figura 3. Implante cirúrgico das fibras ópticas. (A) A superfície total do cranium é exposta e o tecido conjuntivo é apagada. (B) O implante de fibra óptica é mantida em posição com o braço estereotáxico. (C) de cimento dental é aplicado fixação do implante de fibra óptica ao crânio. (D)> 1 mês após a implantação, a pele tenha cicatrizado em torno do implante e não existem sinais de irritação.
Figura 4. Diagrama esquemático do sistema funcional