O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.
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Artigo de método
Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um certo número de drogas como alvo as vias de reparação do ADN e induzem a morte de células através da criação de danos no DNA. Assim, os processos para medir directamente danos no ADN têm sido extensivamente estudados. Os métodos tradicionais são o tempo de consuming, de recursos,, caro, intensivo e requerem células de replicadoras. Em contraste, o ensaio cometa, uma única célula de ensaio de electroforese em gel, é mais rápido, não invasivo, medida, de baixo custo directo e sensível de danos no DNA e de reparação. Todas as formas de danos no DNA, bem como a reparação do ADN pode ser visualizado no nível de célula única usando esta técnica poderosa.
O princípio subjacente ao doseamento é que cometa DNA intacto é altamente ordenada ao passo que o dano ao DNA interrompe essa organização. Os danificadas escoa de ADN na matriz de agarose e quando sujeito a um campo eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao cátodo, que está carregado positivamente. As grandes cadeias de DNA não danificadas não são capazes de migrar longe do núcleo. Danos no DNAcria fragmentos menores de DNA que viajam mais longe do que o DNA intacta. Comet Assay, um software de de análise de imagem, as medidas de e compara o global de intensidade de fluorescente de o DNA em o com um núcleo com DNA de que tenha migrado para fora de o núcleo. Sinal fluorescente do DNA migrado é proporcional aos danos de DNA. Tail DNA mais brilhante significa danos no DNA aumentada. Alguns dos parâmetros que são medidos são momento da cauda, que é uma medida de tanto a quantidade de ADN e de distribuição de ADN no comprimento da cauda a cauda, e percentagem de DNA na cauda. Este ensaio permite medir a reparação do ADN, bem desde resolução de danos no DNA significa reparação teve lugar. O limite de sensibilidade é de aproximadamente 50 quebras na cadeia por diplóide 1,2 células de mamíferos. As células tratadas com quaisquer agentes que danificam o ADN, tais como o etoposido, pode ser utilizado como um controlo positivo. Assim, o teste do cometa é um procedimento rápido e eficaz para avaliar os danos do DNA.
Protocolo
1. Cultura de Células
- Cultura de células neuronais e tratá-los conforme necessário.
- Células de colheita em tubos de 15 ml: meios de aspiração, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS, cálcio e magnésio livre), adicionar tripsina, recolher em tubos de 15 ml e neutralizar a tripsina com meio contendo soro apropriadas.
- Centrifugação a 1000 xg durante 5 min.
- Aspirar mídia.
- Ressuspender as células em PBS.
- Centrifugação a 1000 xg durante 5 min.
- Aspirar mídia e Ressuspender as células em PBS fresco.
- Contar as células usando um hemocitômetro ou seu contador de células preferido.
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Discussão
O teste do cometa tem a capacidade única de analisar células individuais. Isto é vantajoso na identificação de subpopulações de células que demonstram respostas diferenciais aos agentes citotóxicos. Algumas limitações práticas têm de ser tidas em conta. O número de células que podem ser avaliadas individualmente podem variar, dependendo do indivíduo. O tamanho da amostra tem de ser aumentada, se há uma variedade de lesões do ADN dentro de uma população. Suspensão de uma única célula viável é crítica para este ensaio uma.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio IMPACTO do Departamento de Radiação Oncológica da Universidade de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, da Fundação da Criança de combate o câncer, ea Gabrielle Anjo (Fundação para ESY.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Tubos de 1,5 ml | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| TBE 10X (Tris-base, o ácido bórico, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml de tubo | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Folha de alumínio | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Proveta | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifugador | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Cometa software Ensaio | Comet Assay IV Sistema de Análise de Imagem | ||
| Cilindro | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Câmara de eletroforese | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Etanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Microscópio fluorescente | Zeiss Axio Vision | Qualquer microscópio de fluorescência com filtro verde bastará | |
| Hemocitômetro | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Baixo ponto de fusão agarose | Promega | V2111 | |
| Microonda | Sears | ||
| Salina tamponada com fosfato, cálcio, magnésio, livre livre | HyClone | SH3025601 | |
| Fonte de alimentação | BioRad | 1645050 | |
| Geladeira | Sears | ||
| Governante | Staples | ||
| Deslizar | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Cloreto de sódio | Sigma | S7653 | |
| De hidróxido de sódio | Sigma | S5881 | |
| Lauril sarcosinato | Fisher Scientific | S529 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S7585 | |
| Bandeja | Fisela Científico | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Tripsina | HyClone | SH3023601 | |
| Vórtice | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Banho de água | Fisher Scientific | 154622Q |
Referências
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleu....
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Reimpressões e permissões
