Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

Resumo

Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.

Resumo

Perfusão baseado descelularização órgão inteiro recentemente ganhou interesse no campo da engenharia de tecidos, como um meio de criar locais específicos andaimes de matriz extracelular, enquanto que em grande parte preservando a arquitectura nativa do andaime. Até à data, esta abordagem tem sido utilizada para uma variedade de sistemas de órgãos, incluindo o coração, pulmão, fígado e ^1-5. Métodos anteriores para a descelularização de tecidos, sem uma rede de fácil acesso vascular têm contado após a exposição prolongada do tecido a soluções de detergentes, ácidos, ou tratamentos enzimáticos, como um meio para remover os componentes celulares e nucleares a partir do ambiente circundante extracelular ^6-8. No entanto, a eficácia destes métodos articulada sobre a capacidade das soluções para permear o tecido por meio de difusão. Em contraste, a perfusão de órgãos por meio do sistema natural vascular reduzido eficazmente a distância de difusão e transporte facilitado de decellularizatiem agentes para o tecido e os componentes celulares para fora do tecido. Aqui, nós descrevemos um método para a plena decellularize um coração suíno intacta através de perfusão coronariana retrógrada. O protocolo produziu uma totalmente descelularizado cardíaca matriz extracelular (ECM-c) de andaime com a estrutura tridimensional do coração intacto. O nosso método de uso de uma série de enzimas, ácidos e detergentes, juntamente com enxaguamentos hipertónicas e hipotónico para ajudar na remoção e lise de células. O protocolo utilizado uma solução de Tripsina a separar as células da matriz seguido de soluções de Triton X-100 e desoxicolato de sódio para ajudar na remoção do material celular. O protocolo descrito também utiliza velocidades de perfusão superiores a 2 L / min, por períodos de tempo prolongados. A taxa de fluxo elevada, juntamente com a solução muda de agentes de transporte autorizados para o tecido, sem contaminação de detritos celulares e eficaz assegurada a lavagem do tecido. O método descrito removido todo o material nuclear da native tecido cardíaco porcino, criando um local específico cardíaco ECM andaime que pode ser utilizado para uma variedade de aplicações.

Protocolo

1. Preparação de tecidos e Experimento Setup

1. Colheita de órgãos suínos imediatamente após a eutanásia de um abatedouro ou de pesquisa e enxaguar o excesso de sangue. Aparar o coração do excesso de gordura e de tecido, mantendo os átrios e aorta intacta. Aparar a gordura para separar a artéria pulmonar da aorta. Se houver quaisquer cortes no tecido, descartar adequadamente.
2. Enrole cada coração individualmente em papel freezer e armazenar todo o tecido em um congelador -80 ° C durante pelo menos 24 horas para garantir a congelação completa.
3. Quando pronto para uso (geralmente menos do que 3 meses), descongelar um coração porcino intacto co....

Resultados

O efeito da descelularização sobre corações porcinos inteiros naturalmente varia devido a diferenças no tamanho, pressões e arranjo do vaso. Portanto, a composição exacta dos derivados scaffolds da matriz extracelular não será o mesmo de coração para coração. A realização do protocolo descrito produzirá um coração que parece branca ou translúcida, o que indica a perda de material celular. No entanto, é geralmente aceite que um tecido, pode ser considerado como "descelularizado" com base na combinação de alguns.......

Discussão

O presente estudo descreve a metodologia para a descelularização consistente e eficaz de um coração porcino. O protocolo foi uma modificação de um relatório publicado anteriormente ^1, e inclui uma exposição mais longa ao fluxo e pressão elevada, o que proporcionou resultados mais reprodutíveis. O tecido resultante descelularizado atendeu a todos os critérios publicados para a descelularização sucesso de tecido ^2. Solução muda frequentes foram realizadas para limitar a reintrodução do material celul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
Tripsina	Gibco	15090
EDTA	Pescador	BP120-500
NaN3	Sigma	S2002-500G
Triton X-100	Sigma	X100-1L
PBS 10X	Pescador	BP399-20
Deoxicolato de sódio	Sigma	D6750-500G
Ácido Peracético	Pfaltz e Bauer	P05020	35% CAS # 79-21-0
Etanol	Pharmco	111000200
Masterflex bomba de acionamento	Cole Parmer	SI-07524-50
Tubulação Masterflex	Cole Parmer	96400-18	Tamanho 18
Redutor farpado	Cole Parmer	EW-30612-20
Beaker 4L	Fisher Scientific	02-540T