Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Elad Noy; Maor H. Pauker; Mira Barda-Saad

doi:10.3791/50076

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Artigo de método

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

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DOI:

10.3791/50076

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23 de junho de 2013

Elad Noy^*¹ , Maor H. Pauker^*¹ , Mira Barda-Saad¹

¹The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Resumo

A protecção contra doenças infecciosas é mediada pelo sistema imunológico ^1,2. Os linfócitos T são os coordenadores mestre do sistema imunitário, que regula a activação e respostas de várias células imunitárias ^3,4. A activação das células T depende do reconhecimento de antigénios específicos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs). O receptor de antigénio de célula T (TCR) é específico para cada clone de células T e determina a especificidade do antigénio ^5. A ligação do TCR para o antigénio induz a fosforilação dos componentes do complexo TCR. A fim de promover a activação das células T, o sinal deve ser transduzida a partir da membrana para o citoplasma e o núcleo, inicia várias respostas cruciais tais como o recrutamento de proteínas de sinalização para o TCR; da APC (da sinapse imune), a sua activação molecular, rearranjo do citoesqueleto, a elevação da concentração de cálcio intracelular, e as alterações na expressão do gene ^6,7. O correto emitiation e terminação dos sinais de activação é crucial para as respostas de células T apropriadas. A actividade das proteínas de sinalização é dependente da formação e terminação de interacções proteína-proteína, pós translacionais, tais como a fosforilação da proteína, a formação de complexos de proteína, ubiquitinação de proteínas e ao recrutamento de proteínas para vários locais celulares ^8. Compreender o funcionamento interno do processo de ativação de células T é crucial para a pesquisa imunológica e aplicações clínicas.

Diversos ensaios têm sido desenvolvidas a fim de investigar as interacções proteína-proteína, no entanto, os ensaios bioquímicos, tais como o método de co-imunoprecipitação amplamente utilizado, não permitem a localização da proteína para ser discernidos, impedindo assim a observação de informações valiosas sobre a dinâmica de celular mecanismos. Além disso, estes ensaios granel geralmente combinam proteínas de muitas células diferentes que podem estar em diferentes fases da tele investigou processo celular. Isto pode ter um efeito prejudicial na resolução temporal. A utilização de imagens em tempo real de células vivas tanto permite o rastreio espacial das proteínas e a capacidade de distinguir entre os eventos de sinalização temporalmente, derramando assim luz sobre a dinâmica do processo de ^9,10. Apresenta-se um método de imagem em tempo real da formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T. As células T primárias ou linhas de células T, como Jurkat, são transfectadas com plasmídeos que codificam para proteínas de interesse fundidos a proteínas fluorescentes monoméricos, impedindo oligomerização não fisiológico ^11. Vivo células T são eliminadas durante uma lamela pré-revestida com anticorpo de activação de células T ^8,9, o qual se liga ao complexo CD3/TCR, indução da activação de células T ao superar a necessidade de antigénios de activação específicas. As células activadas são constantemente fotografada com a utilização de microscopia confocal. Dados de imagem são analisados para produzir resultados quantitativos, como o colcoeficiente ocalization das proteínas de sinalização.

Protocolo

1. A transfecção de células T

Preparar a solução Nucleofector Amaxa ativado através da mistura de solução "Anexo" do kit para a solução Nucleofector. A solução activada pode ser armazenado a 4 ° C durante até três meses.
Cultivar células T de Jurkat em meio de cultura [10% de soro fetal de vitelo (FCS), uma solução de Penicilina-Estreptomicina a 1%, e 2 mM de L-glutamina em meio RPMI]. Idealmente, as células devem ser utilizados 1-2 semanas depois do descongelamento. Utilizando culturas de células em crescimento logarítmico é crucial para a alta eficiência de transfecção e da sobrevivência celular. Alternativamente, com modificações menores, este protocolo pode ser utilizado com células T primárias, tal como anteriormente descrito ^8. Deve ser enfatizado que, como a duração do processo de activação de células T primárias é mais longa do que a de células T de Jurkat (~ 30 min), uma fase de microscópio montado sistema de incubação deve ser usada para manter os níveis de humidade e de temperatura em todo o CO _2, ativação do processo.
Colete 5× 10 ^6-fase log por transfecção de células T para um tubo de 15 ml.
Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente.
Durante a centrifugação, preparar uma placa de 6 poços. Encher um poço para cada transfecção com 5 ml de meio de cultura, e pré-incubado a 37 ° C.
Recolher os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de RPMI.
Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente.
Durante a centrifugação, a preparação da solução de transfecção. Em um poço de uma placa de 96 poços, misturar 100 ul de solução Amaxa Nucleofector activado, preparado no passo 1, com 5 ug de ADN do plasmídeo de interesse que codifica para uma proteína fluorescente marcado. Idealmente, a concentração de DNA deve ser maior do que 1 ug / ml, a fim de evitar a diluição da solução de transfecção.
Misture bem por pipetagem suave.
Após a centrifugação das células, remova cuidadosamente todo o sobrenadante enquanto não disturbing o sedimento.
Pipetar a solução de ADN / transfecção duas vezes.
Adicionar a solução de DNA / transfecção com o sedimento.
Transferir as células à Amaxa cuvete.
Insira a cuvete no dispositivo Nucleofector Amaxa.
Usar o ajuste H-10 Amaxa transfecção por electroporação (para Jurkat) e T-23 (para as células T primárias).
Remova a placa de 6 poços da incubadora.
Após electroporação, transferir cuidadosamente o sobrenadante com a suspensão de células para a placa de 6 poços utilizando uma pipeta de Pasteur. Um sedimento consistindo em fragmentos de células podem formar. Evitar transferir o sedimento.
Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C.
Transferir 2,5 ml de suspensão de células de cada poço para um poço novo. Adicionar 2,5 ml de meio de cultura quente (descrito no passo 2) a cada poço.
Após 72 h, a transferência das células para um tubo de centrífuga estéril e durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e substituí-lo wipo meio de cultura suplementado com o antibiótico de selecção de células de mamífero apropriada para o plasmídeo utilizado (aplicar uma concentração adequada para os antibióticos usados, foi aplicado a G418 e / ou higromicina em concentrações de 1,3 mg / ml e / ou 0,2 mg / ml, respectivamente). Cultura da suspensão de células num poço fresco. Alternativamente, as células podem ser transfectadas transitoriamente e fotografada 48 horas após a transfecção. Para preparar as células transfectadas transitoriamente, co-transfecção as células com os dois plasmídeos simultaneamente no passo 8, continuando normalmente a etapa 20 e, em seguida, pular diretamente para o passo 23. Note-se que neste cenário, as células devem ser usados imediatamente, e, geralmente, a sua intensidade de fluorescência é heterogênea e não necessariamente de alta.
Cultivar células em meio de cultura suplementado com o antibiótico de selecção apropriado. Dividir as células e complementá-los com meio de cultura suplementado com antibiótico, se necessário.
Após 2 semanas, verificar a transfecção bem sucedida com o uso de FACS (gripeseparação de células activada por orescence) como se segue:
Recolha 10 ⁶ células transfectadas, 10 ⁶ células transfectadas simuladas (controlo negativo), e 10 ⁶ células que são conhecidas por expressar estavelmente a proteína fluorescente marcado. Se as células são transfectadas com mais de uma proteína fluorescente (ver passo 27), o uso de várias linhas de células, individualmente marcados como controlos positivos.
Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente.
Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS (PBS w / o Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} 5% de FCS, 0,05% de azida de sódio).
Use um FACS análise para verificar a fluorescência celular. Comparar a fluorescência das células transfectadas com a dos controlos negativos e positivos.
Para transfectar as células com um adicional, marcados por fluorescência de proteína, repetir os passos 3-26 utilizando as células transfectadas.
Células são visualizadas elevados níveis de fluorescência deveria ser usado. Idealmente, pelo menos, 50% deas células da cultura deve ser altamente fluorescente. Fluorescência celular pode ser aumentada por separação de células por meio de FACS.

As proteínas marcadas com adicionais devem ser fundidos com fluoróforos diferentes e ser codificado em plasmídeos que codificam para diferentes antibióticos de selecção. Meio de selecção para as células transfectadas com mais do que um plasmídeo deve ser suplementado com todos os antibióticos apropriados.

2. De células T Espalhando Preparação de Ensaio

Use Lab-Tek II sistema lamela alemão 4 slides de câmara. Certifique-se de que não arranhar acidentalmente a superfície interior das câmaras, por exemplo, com uma ponta de pipeta, durante a preparação ou utilização.
Preparar 50 ml de solução de preparação da lâmina: Tome 4,6 mL de 12 M (37%) de HCl, adicionar 38,5 ml de etanol a 100%, e 6,9 ml de água bidestilada.
Encha cada câmara do slide com 500 mL solução de preparação da lâmina.
Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
Aspirar a câmaras, secá-los completamente.
Incubar as lâminas descoberto por 1 hora a 45 ° C até secar completamente.
Preparar a solução de poli-L-lisina 0,01% por diluição de 0,1% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) em água duplamente destilada.
Aplicar 500 mL para cada câmara.
Incubar as lâminas durante 15 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar as câmaras, secá-los completamente.
Incubar durante 3 horas a 45 ° C até secar completamente.
Lâminas revestidas podem ser armazenadas secas durante vários meses à temperatura ambiente.
Prepara-se uma solução de anticorpo activador. Utilização de um anticorpo anti-CD3: ou HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) ou UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml em 400 ul de PBS, em cada câmara. Esta solução deve ser preparada pouco antes de preparação.
Encher cada câmara com 400 ul da solução de anticorpo activador.
Incubar a lâmina durante 2 horas a 37 ° C ou, de preferência, durante a noite a 4 ° C.
Remover o anticorpo de activação solenóidebuição e lave imediatamente a câmara duas vezes com 300 mL PBS. A partir deste ponto, certifique-se as câmaras permanecem cheias de buffer.
Armazenar o diapositivo PBS preenchido a 4 ° C. Sugerimos o uso das câmaras de slides preparados dentro de 1 semana.

3. A ativação de células T e Imagem

Preparar tampão de imagiologia [1,25 ml de HEPES (1 M), 10 ml de FCS, 38,75 mL de meio RPMI sem vermelho de fenol]. Tampão de imagiologia pode ser armazenado a 4 ° C após filtração.
Ative o Zeiss LSM 510 Meta microscópio. Aqueça o heatable estrutura de montagem microscópio para 37 ° C. Selecione "Modo Expert".
Clique na aba "Adquirir" e abra as seguintes guias: Lasers; Microscopia; configuração; digitalização; Tempo Series.
Ative os lasers necessários. Para excitação do CGPP e mYFP, defina o Argon / 2 laser para "standby" para 5 min, em seguida, para "on".
Se você executou este ensaio de imagens de células ao vivo antes, usando os mesmos fluorophores, abra o arquivo LSM resultante, clique no botão "reutilização" iengodo, e continuar a partir do passo 9. Caso contrário, continuam a partir do passo 6.
Definir canais utilizando os filtros apropriados para a excitação e de emissão das proteínas fluorescentes utilizados.
Na janela "Scan controle", selecione a opção pilha Z.
Digite os seguintes parâmetros de rastreamento: número de fatias: 5; intervalo: 0,5 m; fatia atual: 3.
Preparar um banho Accublock digital seco (Labnet) a 37 ° C perto do microscópio.
Aquecer o tampão de imagiologia e 37 ° C.
Prepare o slide armazenados por aspiração do PBS, substituindo-o por 600 mL de tampão de imagem quente.
Incubar a lâmina a 37 ° C. Manter a lâmina na incubadora até passo 13, durante pelo menos 15 min.
Colete 5 × 10 ⁵ células T transfectadas.
Centrifugar as células durante 2 minutos a 400 x g.
Descartar o sobrenadante.
Ressuspender as células em 1 ml de tampão de imagiologia quente, e transferi-los para um tubo Eppendorf de 1,5 ml.
Coloque a ttubo est no banho a seco Digital Accublock.
Leve o slide aquecido da incubadora, e montá-lo no microscópio estrutura de montagem aquecido.
Clique no ícone "VIS".
Misture a suspensão de células e remover 1-2 ul.
Inserir a ponta da pipeta para o buffer de imagem de cima da parte inferior da lâmina. Evite coçar o slide.
Semente das células sobre a abertura da objetiva.
Começar imediatamente rastrear visualmente as células fluorescentes como eles descem. Seleccionar uma célula que exibe fluorescência elevada em ambos os canais.
Antes de a célula atinge a superfície da lâmina, activar o modo de LSM.
Alterna apenas uma excitação com laser. Selecione um laser para o qual você tem um canal de DIC.
Definir Zoom para 1. Clique no ícone "Fast XY". Clique no ícone "Stop". Usando a ferramenta Recortar, selecione um ROI centrado na célula.
Definir Zoom para 3. Clique no ícone "Fast XY", em seguida, definir o foco manualmente para ver perfeitamente o celular. Clique no botão "Stop" icon.
Alternar todos os lasers de excitação necessários.
Iniciar a gravação clicando no ícone "StartT". Imagem da célula para a totalidade do processo de difusão (habitualmente 5 min.) Quando terminar, clique no ícone "Stop".
Salve o arquivo.
Para adquirir células adicionais, clique no ícone "VIS". Se há células que ainda não entrou em contato com o fundo do slide, continue a partir do passo 23. Evite células de imagem que já começaram o processo de propagação. Caso contrário, vá para o passo 32.
Se a área de lâmina observada é principalmente desprovida de células, adicionar uma outra alíquota de células continuam a partir do passo (20). Caso contrário, vá para o passo 33.
Para adquirir células adicionais, mover a corrediça de modo que a zona superior da abertura da objectiva é desprovida de células.
Adicionar outra aliquota de células (e continuar no passo 20).
Após a realização de toda a imagem desejada, abrir um arquivo LSM salvos.
Clique em "Galeria", "Time + Z" e "subconjunto".
Selecione o relevant intervalo de tempo e pilha Z.
Salve o novo arquivo.
Realize os passos 35-38 para todos os arquivos de imagem.

4. Análise de dados de imagem

Abra os arquivos usando o software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurich Suíça).
Clique em "Superar". Clique no menu "Processamento de Imagem" e selecione "Troque Tempo e Z". Isso vai ajudar no cultivo correto da imagem.
Clique no botão "Editar" da barra de ferramentas e selecione a opção "Crop 3D" no menu drop. Cortar a imagem para incluir apenas a área circundante da célula. Sugerimos cortar um quadrado de pixels 300 × 300 centrado na célula. Note-se que a forma ea localização da célula pode mudar ao longo do tempo. Observando-se o eixo t, certifique-se de que a célula está dentro da região cortada em todos os momentos.
Clique no menu "Processamento de Imagem" e selecione "Troque Tempo e Z" para restaurar a separação temporal original da imagem.
Pressione o botão "Coloc" na barra de ferramentas principal. Selecione "Construir Tempo Dep. COLOC ". Imaris calculará automaticamente limiares de intensidade para cada canal em cada momento.
Ver os resultados da análise de co-localização, selecionando "Estatísticas Channel". Exportar os dados, clicando em "Export".
Repetir os passos 1 a 6, para cada célula de imagens. Recomenda-se que pelo menos 50 células ser analisados desta forma.
Calcule o coeficiente de co-localização média de Pearson e seu erro padrão ou desvio.