Os astrócitos têm sido reconhecidos como células versáteis que participam em processos biológicos fundamentais, que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais, e reparação do sistema nervoso central. Aqui apresenta-se um processo rápido de obtenção de culturas de astrócitos de rato puros para estudar a biologia desta classe importante de centrais células do sistema nervoso.
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Artigo de método
Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os astrócitos são um tipo de célula abundante no cérebro dos mamíferos, mas há ainda muito que aprender sobre as suas características moleculares e funcionais. Nos sistemas de cultura in vitro de células de astrócitos podem ser utilizados para estudar as funções biológicas destas células gliais em detalhe. Este protocolo de vídeo mostra como obter astrócitos puras através do isolamento e da cultura de células corticais mistas de filhotes de rato. O método baseia-se na ausência de neurónios viáveis e a separação dos astrócitos, oligodendrócitos e microglia, os três principais populações de células da glia do sistema nervoso central, em cultura. Imagens representativas durante os primeiros dias de cultura demonstram a presença de uma população mista de células e indicam o ponto no tempo, quando os astrócitos tornam-se confluentes e deve ser separada da microglia e oligodendrócitos. Além disso, demonstramos a pureza e a morfologia dos astrócitos em cultura astrocítica utilizando colorações imunocitoquímicos para bem estabelecida erecentemente descritos marcadores de astrócitos. Este sistema de cultura pode ser facilmente usado para obter os astrócitos de rato puros e astrócitos meio condicionado para estudar vários aspectos da biologia do astrócito.
Introdução
Os astrócitos são um tipo de célula muito abundantes no sistema nervoso central (SNC). A razão entre os astrócitos de neurónios é 1:3 no córtex de ratos e ratazanas, enquanto que existem 1,4 astrócitos por neurónios no córtex humano 1. Interesse em função de astrócitos aumentou dramaticamente nos últimos anos. A função principal de astrócitos é o seu papel no apoio estrutural e metabólica dos neurônios 2,3. Papéis recém-descobertos para astrócitos abrangem um amplo espectro de funções. Estes incluem guiar a migração de axónios em desenvolvimento e neuroblastos determinados durante o desenvolvimento 4-6, a formação de funções na transm....
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Protocolo
1. Isolamento e Chapeamento de Mixed células corticais
Isolamento celular mista cortical para culturas de astrócitos podem ser realizados utilizando P1 a P4 crias de rato. Para alcançar densidade adequada dos astrócitos é necessário utilizar quatro córtices pup rato por frasco de cultura de tecidos T75. Por conseguinte, os volumes no protocolo que se segue são calculados para uma preparação de células com 4 crias de rato.
- Antes de iniciar o procedimento de dissecção, 30 ml de Pré-aquecer os meios de cultura de astrócitos (DMEM, glucose elevada + 10% de soro fetal de soro de bovino a 1% + Penicilina / Estreptomicina, ver tabela)....
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Resultados
Após o isolamento do cérebro de rato completo (Figura 1A), o cerebelo e os bulbos olfativos tem que ser removido (Figura 1B). Os córtices são descascadas do tronco cerebral do rato (Figura 1C) e meninges do córtex individual (Figura 1D ') são cuidadosamente removida (Figura 1E). Meninges são óbvias pelo sistema artéria meníngea e resultados de remoção incompleta em contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e f.......
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Discussão
O método descrito aqui é baseado na preparação da cultura de astrócitos de cérebros de roedores neonatais, originalmente descritos por McCarthy e Vellis de, em 1980, 27. O método de modificação do isolamento e da cultura de astrócitos corticais a partir de P1 a P4 pós-natal do cérebro de rato aqui apresentado é rápido, rendimentos puros astrócitos primários e é altamente reprodutível. Esta técnica pode ser facilmente transferido para isolar os astrócitos de outras espécies, tais como o rato ou a partir de por.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Apoiado pela Fundação Fazit graduação bolsa para SS, o Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF 01 OE 0803) para KB e da Comissão Europeia FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, ea Fundação Alemã de Pesquisa Grant SCHA 1442 / 3-1 para CS Os autores não têm conflitos de interesses financeiros.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome da solução de trabalho | Companhia | Número de catálogo | Concentração final |
| Astrócitos meios de cultura | |||
| DMEM, glucose elevada | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, inactivado pelo calor | Life Technologies | 10082-147 | A concentração final: 10% |
| Penicilina-Estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | A concentração final: 1% |
| Solução para escavação tecido cerebralestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| A tripsina 2,5% | Life Technologies | 15090-046 | A concentração final: 0,25% |
| Outro | |||
| Etanol a 70% (vol / vol) | Roth | 9065,2 | |
| Poli-D-Lisina | Millipore | A-003-E | 50 ug / ml |
| Água | PAA | S15-012 | grau de cultura de células |
| PBS | PAA | H15-002 | grau de cultura de células |
| Tente 0,05%psin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| Filtro de 0,45 ^ M estéril | Músculo da coxa | 16555 | |
| 3,5 centímetros placa de Petri | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml tubo Falcon | BD Falcon | 352096 | |
| Tubo Falcon de 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| 75 centímetros 2 frasco de cultura de tecidos | BD Falcon | 353136 | |
| Fórceps, bem | Dumont | 2-1032, 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Fórceps ponta plana | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 centímetros tesouras cirúrgicas | Aesculap | BC-140-R | |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ7.5 | |
| Estereomicroscópio Câmera + | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscópio Câmera + | Zeiss, Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifugador | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Banho de água | Julabo | SW20, 37 ° C |
Referências
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabol....
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Reimpressões e permissões
