Os astrócitos têm sido reconhecidos como células versáteis que participam em processos biológicos fundamentais, que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais, e reparação do sistema nervoso central. Aqui apresenta-se um processo rápido de obtenção de culturas de astrócitos de rato puros para estudar a biologia desta classe importante de centrais células do sistema nervoso.
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Artigo de método
Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os astrócitos são um tipo de célula abundante no cérebro dos mamíferos, mas há ainda muito que aprender sobre as suas características moleculares e funcionais. Nos sistemas de cultura in vitro de células de astrócitos podem ser utilizados para estudar as funções biológicas destas células gliais em detalhe. Este protocolo de vídeo mostra como obter astrócitos puras através do isolamento e da cultura de células corticais mistas de filhotes de rato. O método baseia-se na ausência de neurónios viáveis e a separação dos astrócitos, oligodendrócitos e microglia, os três principais populações de células da glia do sistema nervoso central, em cultura. Imagens representativas durante os primeiros dias de cultura demonstram a presença de uma população mista de células e indicam o ponto no tempo, quando os astrócitos tornam-se confluentes e deve ser separada da microglia e oligodendrócitos. Além disso, demonstramos a pureza e a morfologia dos astrócitos em cultura astrocítica utilizando colorações imunocitoquímicos para bem estabelecida erecentemente descritos marcadores de astrócitos. Este sistema de cultura pode ser facilmente usado para obter os astrócitos de rato puros e astrócitos meio condicionado para estudar vários aspectos da biologia do astrócito.
Introdução
Os astrócitos são um tipo de célula muito abundantes no sistema nervoso central (SNC). A razão entre os astrócitos de neurónios é 1:3 no córtex de ratos e ratazanas, enquanto que existem 1,4 astrócitos por neurónios no córtex humano 1. Interesse em função de astrócitos aumentou dramaticamente nos últimos anos. A função principal de astrócitos é o seu papel no apoio estrutural e metabólica dos neurônios 2,3. Papéis recém-descobertos para astrócitos abrangem um amplo espectro de funções. Estes incluem guiar a migração de axónios em desenvolvimento e neuroblastos determinados durante o desenvolvimento 4-6, a formação de funções na transmissão sináptica, sinapse força e de processamento de informações por circuitos neurais 7-9, papéis na barreira hemato-encefálica (BHE) 10 e 11-13 integridade e regulação do tônus vascular cerebral 14. Outra característica importante dos astrócitos é a sua resposta a lesões. Sob astrocyt condições patológicases tornar reactivo e mais regular positivamente a expressão do filamento intermediário glial da proteína fibrilar ácida (GFAP) e inibidores da matriz extracelular (ECM) proteínas 15,16. Astrócitos reativos demarcar o local da lesão do tecido saudável através da formação de uma cicatriz glial, que consiste principalmente de astrócitos proteínas secretadas ECM do sulfato de condroitina proteoglicanos família (CSPG), os principais fatores que inibem a regeneração axonal após lesão do SNC 15-17.
Os astrócitos são originários de radiais gliais (RG), as células durante a embriogênese tarde e vida pós-natal precoce. Após a especificação dos astrócitos ocorreu, precursores de astrócitos migram para as suas posições finais, em que começa o processo de diferenciação terminal. In vivo, os astrócitos parecem estar maduro três a quatro semanas após o nascimento, tal como indicado pela sua morfologia típica 18,19. Uma subpopulação de células de RG converter em astrócitos zona subventricular (do tipo células B). Both RG, e as células do tipo B funcionam como astrócitos do tipo de células estaminais neurais (NSC) durante o desenvolvimento e no adulto, respectivamente. Como astrócitos RG, e as células do tipo B também expressam o transportador glutamato astrócito-específico (GLAST), proteína de ligação ao lípido cérebro (BLBP) e GFAP, indicando que estes marcadores não pode ser exclusivamente utilizado para rotular os astrócitos especificamente adultos. Em contraste com os adultos astrócitos parenquimatosas, que não se dividem no cérebro saudável, RG e B do tipo células exibem potencial das células estaminais, tais como a capacidade de se auto-renovar. A desregulação dos astrócitos tem sido implicada em numerosas patologias, incluindo a doença de Alzheimer 20,21, doença de Huntington, 22, doença de Parkinson 23, 24 e síndrome de Rett doença de Alexander 25. Além disso, os astrócitos reagir a todos os insultos do SNC, levando à activação de astrócitos e a formação de cicatriz glial astrocítica 16,26. A cicatriz glial astrocitária que forma tr cérebro seguinteauma lesão da medula espinhal ou é pensado para ser a principal barreira impedindo a regeneração neuronal 15.
O desenvolvimento de métodos fiáveis para isolar e manter populações puras de células tem sido essencial para a compreensão do sistema nervoso. Trabalho pioneiro de McCarthy e de Vellis permite investigadores a data para preparar culturas quase puras de astrócitos do tecido de ratos neonatos 27. Muito tem sido aprendido sobre a biologia astrócitos usando este método, que é apresentado aqui em uma forma ligeiramente modificada para isolar astrócitos de rato corticais. Complementando os estudos in vivo, astrócitos, bem como meio condicionado obtido usando o descrito na cultura in vitro, são ferramentas valiosas para continuar a obter insights sobre funções de astrócitos.
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Protocolo
1. Isolamento e Chapeamento de Mixed células corticais
Isolamento celular mista cortical para culturas de astrócitos podem ser realizados utilizando P1 a P4 crias de rato. Para alcançar densidade adequada dos astrócitos é necessário utilizar quatro córtices pup rato por frasco de cultura de tecidos T75. Por conseguinte, os volumes no protocolo que se segue são calculados para uma preparação de células com 4 crias de rato.
- Antes de iniciar o procedimento de dissecção, 30 ml de Pré-aquecer os meios de cultura de astrócitos (DMEM, glucose elevada + 10% de soro fetal de soro de bovino a 1% + Penicilina / Estreptomicina, ver tabela) a 37 ° C. Um casaco frasco T75 com 20 ml de poli-D-lisina (PDL), a uma concentração de 50 ug / ml em água de grau de cultura de células durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO2.
- Para o procedimento de dissecção, preparar todos os reagentes e materiais necessários. Você vai precisar de: uma tesoura cirúrgica, lisas pinça fina, pinças ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, 70% de etanol umd 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) sobre gelo enchido com 2 ml de HBSS a cada.
- Segurar delicadamente e pulverizar a cabeça e pescoço do rato filhote com etanol 70%. O animal é sacrificado por decapitação utilizando uma tesoura.
- Realizar uma incisão na linha média, posterior para anterior, ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio.
- Corte o crânio cuidadosamente desde o pescoço até o nariz. Dois cortes adicionais são realizados para permitir o acesso ainda mais para o cérebro: O primeiro corte é feito anterior dos bulbos olfatórios, o outro inferior do cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio.
- Usando a pinça de ponta plana, as abas cranianas são suavemente virado para o lado e o cérebro é retirado e colocado no primeiro prato de dissecação cheio com HBSS. Coloque o prato de volta no gelo e continuar a colher todos os quatro cérebros.
- O resto do procedimento de dissecção é realizada sob um estereomicroscópio. Em primeiro lugar, os bulbos olfativos e no cerebelo são removidos usando o finofórceps de dissecção (Figura 1B).
- A fim de recuperar o córtex, pegue a extremidade posterior do cérebro com a pinça fina, realizar uma incisão entre os hemisférios, inserir um segundo conjunto de pinça para o bosque criado e retire a estrutura da placa-como o córtex do cérebro.
- Dissecar cuidadosamente as meninges dos hemisférios corticais, puxando com o fórceps finos (Figura 1D). Este passo evita a contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos. Transfira os hemisférios corticais preparadas para o segundo prato cheio com HBSS e devolvê-lo em gelo. Continuar de acordo com todos os 4 cortices.
- Finalmente, cortar cada hemisfério do córtex em pequenos pedaços, utilizando lâminas cortantes (cerca de 4 a 8 vezes).
- Sob condições estéreis, pedaços de córtex de transferência para um tubo Falcon de 50 ml e adicionar HBSS para um volume total de 22,5 ml.
- Adicionar 2,5 ml de 2,5% de tripsina, misturar e incubaro tecido no banho de água a 37 ° C durante 30 min. Misturar por agitação ocasional cada 10 min.
- Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg para peças de tecido do córtex da pelota.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por decantação. A fim de evitar a perda do tecido pellet pode ser mecanicamente retê-lo usando uma pipeta. Dissociar o tecido numa única suspensão de células por adição de 10 ml de meio de revestimento de astrócitos e pipetagem vigorosa com uma pipeta de plástico de 10 ml até pedaços de tecido são dissociadas em células individuais (20 a 30 vezes). Ajustar o volume a 20 ml com o meio de revestimento de astrócito. Pode prova a dissociação do tecido do córtex em células individuais por contagem usando um hematocytometer. Uma preparação de 4 córtices rato filhote deve render 10-15 x10 6 dissociadas células individuais.
- Aspirar PDL a partir do balão de cultura T75, a placa de suspensão de células dissociadas único e incubar a 37 ° C na incubadora de CO2.
2. Obtenção de um EnrCultura astrocitária iched
- Altere as médias 2 dias após o plaqueamento das células corticais e mistas todos os 3 dias seguintes.
- Depois de 7-8 dias, quando os astrócitos microglia são confluentes e sobreposição sentar exposta sobre a camada de astrócitos são ou já separado da camada de astrócitos (Figura 2), agitar o frasco T75 a 180 rpm durante 30 min num agitador orbital a remover microglia. Descartar o sobrenadante contendo microglia ou se deseja para a cultura e examinar microglia, girá-lo para baixo e placa para cultura de 28,29.
- Adicionam-se 20 ml de meio de cultura fresco astrócitos e continuar agitando o frasco a 240 rpm durante 6 h para remover as células precursoras de oligodendrócitos (OPC). Uma vez que alguns OPCs não destacar completamente a partir da camada de astrócitos, continuar a agitar vigorosamente à mão durante 1 minuto, a fim de evitar a contaminação do OPC. Descartar o sobrenadante ou girá-lo para baixo e placa, se quiser cultura OPCs 29.
- Lave o restante confluent camada de astrócitos duas vezes com PBS, aspirar o PBS, adicionar 5 ml de tripsina-EDTA e incubado no incubador de CO2 a 37 ° C. Verifique destacamento de astrócitos a cada 5 minutos e fazer cumprir destacamento de astrócitos por bater o frasco contra a palma da sua mão (2-3 vezes).
- Depois de astrócitos são separadas do frasco de cultura, adicionam-se 5 ml de meio de cultura de astrócitos, células de rotação a 180 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e adicionar 40 ml de meio de revestimento fresco de astrócitos. Um frasco de cultura de tecidos T75 deve render cerca de 1x10 6 células após o desdobramento primeira célula. As células da placa em dois frascos de cultura T75 e incubar a 37 ° C na incubadora de CO2. Alterar o meio a cada 2 a 3 dias.
- 12-14 dias após a primeira divisão astrócitos são plaqueadas na célula concentração adequada 24-48 horas antes de realizar a experiência. Um frasco de cultura de tecidos T75 deve render cerca de 1,5-2 x10 6 células após a separação segunda célula.
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Resultados
Após o isolamento do cérebro de rato completo (Figura 1A), o cerebelo e os bulbos olfativos tem que ser removido (Figura 1B). Os córtices são descascadas do tronco cerebral do rato (Figura 1C) e meninges do córtex individual (Figura 1D ') são cuidadosamente removida (Figura 1E). Meninges são óbvias pelo sistema artéria meníngea e resultados de remoção incompleta em contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e f...
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Discussão
O método descrito aqui é baseado na preparação da cultura de astrócitos de cérebros de roedores neonatais, originalmente descritos por McCarthy e Vellis de, em 1980, 27. O método de modificação do isolamento e da cultura de astrócitos corticais a partir de P1 a P4 pós-natal do cérebro de rato aqui apresentado é rápido, rendimentos puros astrócitos primários e é altamente reprodutível. Esta técnica pode ser facilmente transferido para isolar os astrócitos de outras espécies, tais como o rato ou a partir de por...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Apoiado pela Fundação Fazit graduação bolsa para SS, o Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF 01 OE 0803) para KB e da Comissão Europeia FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, ea Fundação Alemã de Pesquisa Grant SCHA 1442 / 3-1 para CS Os autores não têm conflitos de interesses financeiros.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome da solução de trabalho | Companhia | Número de catálogo | Concentração final |
| Astrócitos meios de cultura | |||
| DMEM, glucose elevada | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, inactivado pelo calor | Life Technologies | 10082-147 | A concentração final: 10% |
| Penicilina-Estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | A concentração final: 1% |
| Solução para escavação tecido cerebralestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| A tripsina 2,5% | Life Technologies | 15090-046 | A concentração final: 0,25% |
| Outro | |||
| Etanol a 70% (vol / vol) | Roth | 9065,2 | |
| Poli-D-Lisina | Millipore | A-003-E | 50 ug / ml |
| Água | PAA | S15-012 | grau de cultura de células |
| PBS | PAA | H15-002 | grau de cultura de células |
| Tente 0,05%psin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| Filtro de 0,45 ^ M estéril | Músculo da coxa | 16555 | |
| 3,5 centímetros placa de Petri | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml tubo Falcon | BD Falcon | 352096 | |
| Tubo Falcon de 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| 75 centímetros 2 frasco de cultura de tecidos | BD Falcon | 353136 | |
| Fórceps, bem | Dumont | 2-1032, 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Fórceps ponta plana | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 centímetros tesouras cirúrgicas | Aesculap | BC-140-R | |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ7.5 | |
| Estereomicroscópio Câmera + | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscópio Câmera + | Zeiss, Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifugador | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Banho de água | Julabo | SW20, 37 ° C |
Referências
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Reimpressões e permissões
