Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em&gt; Milho rayado fino vírus</em&gt; Partículas semelhantes a vírus produzidas em<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP

Resumo

Um método para analisar a acessibilidade do solvente do grupo tiol de resíduos de cisteína de Milho rayado fino vírus (MRFV)-partículas semelhantes a vírus (VLPs), seguido por uma reacção de ligação cruzada de péptidos é descrito. O método tira partido da existência de grupos químicos sobre a superfície das partículas VLP, que podem ser alvos para as reacções específicas.

Resumo

Imitando e explorar as propriedades e características físico-químicas, vírus e física tem a promessa de fornecer soluções para alguns dos desafios mais prementes do mundo. A variedade e tipos de vírus, juntamente com suas propriedades intrigantes, potencialmente, dar oportunidades infinitas para aplicações em tecnologias baseadas em vírus. Vírus têm a capacidade de se auto-organizar em partículas com forma e tamanho discreto, a especificidade de simetria, polivalência e propriedades estáveis ​​sob uma variedade de condições de temperatura e pH. Não surpreendentemente, com uma gama tão extraordinária de propriedades, os vírus são propostas para uso em biomateriais ^{9, 14, 15} vacinas, materiais eletrônicos, ferramentas químicas e molecular recipientes eletrônico ^{4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.}

A fim de utilizar os vírus em nanotecnologia, eles devem ser modificados a partir de suas formas naturais para conferir novas funções. Este pr desafiadorocesso pode ser realizada através de vários mecanismos, incluindo a modificação genética do genoma virai e a fixação de moléculas quimicamente estrangeiras ou desejado para as partículas de vírus grupos reactivos ^8. A capacidade de modificar vírus principalmente depende das propriedades físico-químicas e físicas do vírus. Além disso, as modificações genéticas ou físico-química precisam ser executadas sem afectar adversamente a estrutura do vírus nativo e função do vírus. Maize rayado fino vírus proteínas (MRFV) revestimento auto-montar em Escherichia coli produtoras de VLPs estáveis ​​e vazios que são estabilizadas por proteína-proteína interações e que pode ser usado em aplicações baseadas em tecnologias vírus ^8. VLPs produzidas em plantas de tabaco foram examinados como um andaime sobre o qual uma grande variedade de péptidos pode ser covalentemente exibida ^13. Aqui, descrevem-se as etapas de: 1) determinar quais as cisteínas solventes acessíveis em um capsídeo do vírus estão disponíveis para modificaçãocação, e 2) Bioconjugate péptidos aos capsídios modificados. Usando nativas ou mutationally-inserido resíduos de aminoácidos e as tecnologias de acoplamento normalizados, uma grande variedade de materiais tem sido apresentados na superfície de vírus de plantas, tais como, o vírus do mosaico Brome ^3, vírus Carnation mottle ^12, Cowpea cloróticas mottle virus ^6, do mosaico do tabaco ¹⁷ vírus, o vírus do mosaico do nabo amarelo ^1, e MRFV ^13.

Protocolo

1. A inoculação do vírus e purificação de VLPs Plantas de Nicotiana benthamiana

1. Produzir seladas T7-RNA transcritos a partir de Potato virus X (PVX) baseados em plasmídeos vector transportando MRFV de tipo selvagem (wt) e da proteína de revestimento Cys-mutada (CP) genes ^12, utilizando T7-mMessage Ambion de mMachine Kit.
2. Para cada reacção de transcrição de T7, inocular duas folhas completamente expandidas de N. benthamiana com 10 ul de reacções e incuba-se as plantas durante 10 dias em estufa, a uma humidade de 60% ​​durante 16 h com luz (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 horas escuro a 20 ° C.
3. Harves....

Resultados

Expressão transitória de mutantes casaco MRFV proteína (PB) genes em N. benthamiana plantas em um PVX VLPs baseadas em vetor produção está descrito na Figura 1. A modificação MRFV gene da proteína da cápside é amplificado por PCR e, em seguida, colocado sob o controlo transcricional do promotor duplicado subgenómico CP num vector baseado PVX, pP2C2S ^2, (uma oferta de D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inglaterra). Na transcrição de ARN in vitro produz tr.......

Discussão

O método aqui apresentado permite uma análise muito sensível e rápida de cisteínas reactivos presentes na superfície das plantas produzidas VLPs, bem como em outros complexos de proteínas. As maleimidas são específicas de reagentes de tiol, que reagem com o grupo sulfidrilo livre que contêm moléculas de modo a formar ligações tioéter estáveis. Este método baseia-se na especificidade das maleimidas para reagir com grupos sulfidrilo que não estão envolvidos em interacções com outros aminoácidos. A preservação da estrutura.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Thinwall, Ultra-Clear Tubos	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Tecnologias de vida	AM1344M
F luoresceina-5-maleimida	Vida Thermo Scientific Technologies	46130 F150	46130 está fora de ordem com substituto F150
Pierce Kit quantificação Biotina	Thermo Scientific	28005
EZ-Link Maleimida PEG2-Biotina, No-Pesar Formato	Thermo Scientific	21901
SM (PEG) n Reticuladores	Thermo Scientific	22107
10-20% de Tris-Glicina gel	Invitrogen	EC61352
Tampão de Laemmli	Bio-Rad	1610737
Tris Glycine SDS tampão de corrida	Invitrogen	LC2675
Tris Glycine Transferência de buffer	Invitrogen	LC3675
Membrana de nitrocelulose Sandwich papel de filtro	Invitrogen	LC2001
Afinidade fosfatase Labeled anticorpo purificado a IgG de coelho	Kirkegaard and Perry Laboratories	0751516
NBT / BCIP de substrato de fosfatase	Kirkegaard and Perry Laboratories	508107