Um método para analisar a acessibilidade do solvente do grupo tiol de resíduos de cisteína de Milho rayado fino vírus (MRFV)-partículas semelhantes a vírus (VLPs), seguido por uma reacção de ligação cruzada de péptidos é descrito. O método tira partido da existência de grupos químicos sobre a superfície das partículas VLP, que podem ser alvos para as reacções específicas.
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Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em
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Resumo
Resumo
Imitando e explorar as propriedades e características físico-químicas, vírus e física tem a promessa de fornecer soluções para alguns dos desafios mais prementes do mundo. A variedade e tipos de vírus, juntamente com suas propriedades intrigantes, potencialmente, dar oportunidades infinitas para aplicações em tecnologias baseadas em vírus. Vírus têm a capacidade de se auto-organizar em partículas com forma e tamanho discreto, a especificidade de simetria, polivalência e propriedades estáveis sob uma variedade de condições de temperatura e pH. Não surpreendentemente, com uma gama tão extraordinária de propriedades, os vírus são propostas para uso em biomateriais 9, 14, 15 vacinas, materiais eletrônicos, ferramentas químicas e molecular recipientes eletrônico 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
A fim de utilizar os vírus em nanotecnologia, eles devem ser modificados a partir de suas formas naturais para conferir novas funções. Este pr desafiadorocesso pode ser realizada através de vários mecanismos, incluindo a modificação genética do genoma virai e a fixação de moléculas quimicamente estrangeiras ou desejado para as partículas de vírus grupos reactivos 8. A capacidade de modificar vírus principalmente depende das propriedades físico-químicas e físicas do vírus. Além disso, as modificações genéticas ou físico-química precisam ser executadas sem afectar adversamente a estrutura do vírus nativo e função do vírus. Maize rayado fino vírus proteínas (MRFV) revestimento auto-montar em Escherichia coli produtoras de VLPs estáveis e vazios que são estabilizadas por proteína-proteína interações e que pode ser usado em aplicações baseadas em tecnologias vírus 8. VLPs produzidas em plantas de tabaco foram examinados como um andaime sobre o qual uma grande variedade de péptidos pode ser covalentemente exibida 13. Aqui, descrevem-se as etapas de: 1) determinar quais as cisteínas solventes acessíveis em um capsídeo do vírus estão disponíveis para modificaçãocação, e 2) Bioconjugate péptidos aos capsídios modificados. Usando nativas ou mutationally-inserido resíduos de aminoácidos e as tecnologias de acoplamento normalizados, uma grande variedade de materiais tem sido apresentados na superfície de vírus de plantas, tais como, o vírus do mosaico Brome 3, vírus Carnation mottle 12, Cowpea cloróticas mottle virus 6, do mosaico do tabaco 17 vírus, o vírus do mosaico do nabo amarelo 1, e MRFV 13.
Protocolo
1. A inoculação do vírus e purificação de VLPs Plantas de Nicotiana benthamiana
- Produzir seladas T7-RNA transcritos a partir de Potato virus X (PVX) baseados em plasmídeos vector transportando MRFV de tipo selvagem (wt) e da proteína de revestimento Cys-mutada (CP) genes 12, utilizando T7-mMessage Ambion de mMachine Kit.
- Para cada reacção de transcrição de T7, inocular duas folhas completamente expandidas de N. benthamiana com 10 ul de reacções e incuba-se as plantas durante 10 dias em estufa, a uma humidade de 60% durante 16 h com luz (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 horas escuro a 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana infectadas por vírus folhas 10 dias após a inoculação (dpi), pesar o tecido vegetal (50 gramas) e colocar em gelo.
- Homogeneizar o material de planta em um misturador em presença de 100 ml de uma solução gelada de 0,5 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5 (o uso de 2 ml de tampão por grama de tecido de planta).
- Filtrar homogenato através de 3 camadas de cheeseclOTH e clarificar através de centrifugação a 27.000 xg durante 30 min. Transferir o sobrenadante em um cilindro refrigerado graduada, medir o volume, e depois transferir para um copo gelado estéril. Descartar o sedimento.
- Processar-se o sobrenadante por adição de polietileno glicol 8000 a 10% (PEG 8000), agita-se durante 15 min a 4 ° C, e incubar durante mais 45 minutos a 4 ° C para precipitar as partículas semelhantes a vírus (VLPs) de PEG-matriz.
- Centrifugar a amostra a 27.000 xg durante 20 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante.
- Processar o sedimento, adicionando 8 ml de 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5, contendo 2% de Triton X-100. Redemoinho tubos da centrífuga bem para liberar o sedimento. Transferir o sedimento e tampão para um copo de gelado estéril. Enxaguar imediatamente os tubos com 2 ml do mesmo tampão e adicionar ao copo. Agita-se a suspensão a 4 ° C até que os grânulos são dissolvidos (em geral 1 hora).
- Clarificar por centrifugação durante 5 min a 27.000 xg, rejeitar o sedimento, e process o sobrenadante por centrifugação a 140000 xg durante 2 horas a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de 0,05 M de Na-citrato, pH 5,5 e colocar a suspensão no topo de um gradiente de sacarose 10-40% feita em 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5.
- Centrifuga-se o gradiente durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C.
- Brilhar uma luz sobre o topo do tubo da centrífuga e recolher a banda de dispersão da luz superior a 4 cm a partir do topo do tubo, diluiu-se com 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5.5, e centrifuga-se durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 0,5 ml de água estéril e armazenar a 4 ° C durante até seis meses.
- Quantificar a concentração de VLPs por realização de um ensaio de proteína de Bradford. O rendimento de VLPs está entre 1 e 3 ng / g de tecido da planta.
2. Fluoresceína-5-maleimida rotulagem Reações de VLP
- Prepara-se uma solução 1 mM de f luoresceina-5-maleimida (427,37 g / mole) em 50 mM de sódio phosphate tampão, pH 7,0, 1 mM de EDTA. Misturar utilizando o vórtice e verificar dissolução completa. Proteger o tubo de luz, utilizando uma folha de alumínio.
- Adicionar fluoresceína-5-maleimida de VLPs produzidas no passo 1 e misturar. Usar um excesso de 25 vezes molar de f luoresceina-5-maleimida para a quantidade molar de sulfidrilos. Geralmente, utilizar-se 30 ul de partículas VLP, na concentração de 1 ug / ul e 60 ul da solução de fluoresceína-5-maleimida produz resultados aceitáveis.
- Incubar a mistura reaccional durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Terminar a reacção por adição de ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 50 mM.
- Remover não reagidos fluoresceína, utilizando uma coluna de spin de dessalinização (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugação durante 2 minutos a 1500 xg à temperatura ambiente.
- Por análise de SDS-PAGE, adicionam-se 10 ul de 2 x tampão de amostra de SDS-PAGE de Laemmli a 10 ul de cada reacção. Armazenar a proteína marcada ao abrigo da luz a 4 ° C, durante até um mês oude utilização única em alíquotas a -20 ° C até 3 meses.
3. Reação rotulagem e determinação de Incorporação Biotina
- Use colunas de centrifugação de dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) para realizar uma permuta de tampão de água a uma solução de tampão fosfato salino (PBS), pH 7,0 as VLPs produzidas no passo 1.
- Prepare uma solução de 20 mM de maleimida-PEG2-biotina, adicionando 190 ul de PBS em No-Pesar maleimida PEG2-biotina e misture pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar maleimida-PEG2-biotina para as VLPs e misturar. Usar um excesso molar de 10 vezes de reagente de VLPs soluções ≤ 2 mg / ml.
- Incubar a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas.
- Remover não reagidos maleimida-PEG2-biotina, utilizando uma coluna de dessalinização de spin (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugação durante 2 minutos a 1500 xg à temperatura ambiente.
- Determinar as moles de biotina por moles de VLPs utilizando o Kit Pierce Quantitation Biotina (Thermo Scientific) e following instruções do fabricante.
4. A ligação cruzada de 2-Cys e VLPs Peptide F
- VLPs que resultou em resíduos de cisteína disponível para a ligação cruzada no passo 2 (2-Cys VLPs) são utilizados no passo seguinte. Preparar uma solução-mãe fresca de reticulação (28,63 mM) por dissolução de 10 mg de agente de reticulação-NHS-PEG4-maleimida em 680 uL de sulfóxido de dimetilo.
- Dissolver a 17 (F)-amino ácido do péptido longo (LLPNMOKDKEACAKAPL) em 50 ul de tampão de conjugação (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM de EDTA) a uma concentração de 0,1 mM.
- Adicionar 4 ul de agente de reticulação de 50 ul de péptido dissolvido (proteína-NH2) a uma concentração de mM final (que é um excesso molar de 10 vezes para 0,1 mM de solução de péptido).
- Incubar a mistura reaccional durante 2 horas a 4 ° C.
- Purificar reticulado péptido utilizando uma coluna de dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrada com tampão de conjugação (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) por centrifugação a 1500 xg, durante 1 minuto à temperatura ambiente.
- Defina-se a mistura de reacção combinando VLPs (proteína-SH) e de ligação cruzada de péptidos (proteína-NH2), em uma proporção molar determinada pelo número de aminas e tióis activados envolvidos na reacção e a diferença de peso molecular entre VLPs e peptídicas.
- Incubar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas a 4 ° C.
- Para a análise de Western blot, misturar o produto resultante conjugado de 1:1 com tampão Laemmli, deixar ferver por 10 minutos, e continuar com SDS-PAGE num molde pré-10-20% de Tris-Glicina gel (Invitrogen), seguido de electrotransferência para uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen). Bloquear as membranas com 1 x PBS, pH 7,2, contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) e leite em pó desnatado a 5% e com sonda de anticorpos específicos do péptido, seguido pelo anticorpo marcado com fosfatase secundário apropriado.
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Resultados
Expressão transitória de mutantes casaco MRFV proteína (PB) genes em N. benthamiana plantas em um PVX VLPs baseadas em vetor produção está descrito na Figura 1. A modificação MRFV gene da proteína da cápside é amplificado por PCR e, em seguida, colocado sob o controlo transcricional do promotor duplicado subgenómico CP num vector baseado PVX, pP2C2S 2, (uma oferta de D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inglaterra). Na transcrição de ARN in vitro produz tr...
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Discussão
O método aqui apresentado permite uma análise muito sensível e rápida de cisteínas reactivos presentes na superfície das plantas produzidas VLPs, bem como em outros complexos de proteínas. As maleimidas são específicas de reagentes de tiol, que reagem com o grupo sulfidrilo livre que contêm moléculas de modo a formar ligações tioéter estáveis. Este método baseia-se na especificidade das maleimidas para reagir com grupos sulfidrilo que não estão envolvidos em interacções com outros aminoácidos. A preservação da estrutura...
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Divulgações
Menção dos nomes comerciais de produtos comerciais na publicação é exclusivamente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubos | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Tecnologias de vida | AM1344M | |
| F luoresceina-5-maleimida | Vida Thermo Scientific Technologies | 46130 F150 | 46130 está fora de ordem com substituto F150 |
| Pierce Kit quantificação Biotina | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimida PEG2-Biotina, No-Pesar Formato | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM (PEG) n Reticuladores | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% de Tris-Glicina gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Tampão de Laemmli | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS tampão de corrida | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transferência de buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Membrana de nitrocelulose Sandwich papel de filtro | Invitrogen | LC2001 | |
| Afinidade fosfatase Labeled anticorpo purificado a IgG de coelho | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT / BCIP de substrato de fosfatase | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
Referências
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Reimpressões e permissões
