Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Sharanya Iyengar; Yariv Houvras; Craig J. Ceol

doi:10.3791/50086

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

13.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/50086

⸱

13 de novembro de 2012

Sharanya Iyengar¹ , Yariv Houvras²^,³ , Craig J. Ceol¹

¹Program in Molecular Medicine and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School, ²Departments of Surgery and Medicine, Weill Cornell Medical College , ³Departments of Surgery and Medicine, New York Presbyterian Hospital

Neste artigo

Resumo

Uma forma rápida de tela para modificadores de melanoma, utilizando um modelo de tumor zebrafish autóctone é apresentado. Leva vantagem de o vector miniCoopR que permite a expressão de genes candidatos de melanoma nos melanócitos. Um método para obtenção das curvas de sobrevida livre de melanoma, um ensaio de invasão, um protocolo para a coloração de anticorpos de melanócitos de escala e um ensaio de transplante de melanoma são descritos.

Resumo

Estudos genômicos de cânceres humanos produziram uma riqueza de informações sobre os genes que são alterados em tumores ^1,2,3. Um desafio proveniente destes estudos é que muitos genes é alterada, e isso pode ser difícil distinguir as alterações genéticas que levaram tumorigénese de que aqueles surgiu incidentalmente durante a transformação. Para fazer esta distinção é benéfico ter um ensaio que pode medir quantitativamente o efeito de um gene alterado em iniciação do tumor e de outros processos que permitem que os tumores de persistir e disseminar. Apresentamos aqui um meio rápido para pesquisar um grande número de modificadores candidatos de melanoma no peixe-zebra utilizando um modelo de ⁴ autóctone tumor que inclui os passos necessários para a iniciação e manutenção de melanoma. Um reagente chave no presente ensaio é o vector miniCoopR, que acopla a cópia de tipo selvagem do factor especificação mitfa melanócito para uma cassete na qual a recombinação gateway candidato melAnoma genes podem ser recombinados ^5. O vector tem um minigene miniCoopR resgate mitfa que contém o promotor, quadros de leitura aberta e região 3 'não traduzida do gene de tipo selvagem mitfa. Ele permite fazer construções de comprimento total, utilizando quadros de leitura abertos de modificadores de melanoma candidatos. Estes clones individuais podem então ser injetado em uma única célula de Tg (mitfa: BRAF ^V600E), p53 (lf); embriões mitfa (LF) zebrafish. O vector miniCoopR fica integrado por Tol2 mediada por transgénese ⁶ e resgates melanócitos. Porque eles são fisicamente acoplados ao resgate mitfa minigene, genes candidatos são expressos em melanócitos resgatados, alguns dos quais irão transformar e desenvolver-se em tumores. O efeito de um gene candidato para a iniciação melanoma e as propriedades das células de melanoma pode ser medida utilizando as curvas de sobrevida livre de melanoma, ensaios de invasão, coloração de anticorpos e ensaios de transplante.

Protocolo

1. Triagem para Modificadores Onset Melanoma

Criar clones porta de entrada do meio de amplificação do PCR de comprimento completo de leitura aberta de genes de interesse (GOI) e recombinação em pDONR 221 utilizando BP clonase II (Invitrogen). Use Multisite gateway tecnologia (Invitrogen) para se recombinam p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ⁶ e miniCoopR ⁵ para colocar os genes de interesse sob o promotor no vector mitfa miniCoopR (Figura 1A).
Injectar 25 picogramas de cada clone, juntamente com 25 picogramas de mRNA Tol2 transposase numa única célula-Tg (mitfa: BRAF ^V600E), p53 (lf); mitfa (lf) de embriões zebrafish triplamente homozigóticos como descrito anteriormente ^7. Incubar os embriões injetados em 28,5 ° C. Remova todos os embriões mortos em 24 hpf.
Selecione animais transgênicos com melanócitos resgatados a 72 hpf colocando a placa de Petri contendo embriões injetados em um microscop dissecare sob a luz incidente sobre um fundo branco (Figura 1A).
Transferir os animais para três tanques L no berçário da unidade zebrafish a 4 dpf como descrito anteriormente ^8.
Aos 2 meses, seleccionar os animais com, pelo menos, uma área de recuperação de melanócitos maior do que 4 mm ² (Figura 1A). Existe uma forte correlação entre o grau de recuperação dos melanócitos a 72 hpf e o grau de recuperação dos melanócitos menos 2 meses. Quando embriões com resgate de melanócitos são colhidas a 72 hpf, a maioria (~ 80%) que tem pelo menos uma área de recuperação de melanócitos maior do que 4 mm ² em 2 meses.
Tela de os animais seleccionados semanais para a presença de tumores (Figura 1B). Há uma forte correlação entre as alterações histopatológicas e morfológica. Transição do benigno para maligno é reconhecida como uma alteração morfológica, quando lesões tornam-se levantada para fora da superfície do animal. Isolar anima rolamento tumorls para estudo.
Desenhar as curvas de sobrevida livre de melanoma com a idade em semanas na abcissa e por cento melanoma sobrevida livre na ordenada. Os animais com os melanócitos que expressam um gene de interesse são comparadas com os animais de controlo que expressam EGFP (enhanced green fluorescent protein) nos melanócitos (Figura 1C). O início médio do tumor para os animais injectados com miniCoopR-EGFP é de aproximadamente 18 semanas. Determinar se as duas curvas são estatisticamente diferentes através de um teste de log rank.

2. Ensaio de Invasão Tumoral

Seleccione zebrafish isolado que desenvolvem tumores dorsalmente, numa região situada entre o limite posterior do cérebro posterior e borda anterior da barbatana dorsal (Figura 2A).
Duas semanas após o início melanoma sacrificar os peixes de acordo com as orientações especificadas pelo Painel Associação Médica Veterinária Americana sobre a eutanásia e aprovado pela Universidade de Medicina de Massachusetts InsAnimal Care e do Comitê titutional Uso (IACUC). Especificamente, um peixe é colocada num prato com 0,6 mg / ml até tricaina brânquia movimento pára.
Fazer uma incisão na cavidade peritoneal de o peixe com um escalpelo e, em seguida, colocar o peixe em paraformaldeído a 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C para a fixação.
Trata-se com 0,5 M de EDTA durante a noite a 4 ° C a descalcificação.
Fixar com formalina na cassete durante a noite, desidratar durante 1 h, claro, com xileno 3 vezes durante 1 hora e em seguida trata-se com parafina duas vezes durante 2 horas cada, a 60 ° C.
Incorporar o tecido em parafina num molde e deixar solidificar durante 30 minutos a 1 hora.
Fazer 5 mm de cada um, 50 um. As secções transversais e devem ser através de toda a lesão a fim de que o ponto mais profundo da invasão pode ser identificado. Siga pela hematoxilina e eosina.
Avaliar a invasão tumoral medindo se células tumorais permanecem fora do colágeno estrato compactum, invadir na dorsalmusculatura ou invadir ainda mais para a coluna vertebral (Figura 2B, C). Determinar diferença estatística entre os dois conjuntos de amostras.

3. A coloração de anticorpo de melanócitos Escala

Perfazer com tampão PO4 80 ml 0,1 M de Na ₂ HPO ₄ e 20 ml de 0,1 M de NaH ₂ PO _4. Verifique se o pH é 7,3. Tornar-se tampão de solução 2x contendo 8,0 g de sacarose, 0,15 ml de CaCl ₂ 0,2 M e 90 ml de 0,2 M de tampão _PO4, pH 7,3. Se necessário ajustar o pH para 7,3 com NaOH ou HCl, em seguida, completar a 100 ml com tampão de PO _4.
Pesar até 300 mg de sólido PFA e adicionar a um tubo de microcentrífuga. Adicionar NaOH 5 mM para um volume igual a 4,5 x a massa, em mg, de PFA (por exemplo, 450 ul de 5 mM de NaOH e 100 mg de PFA). Aquece-se a 60-70 ° C com agitação ocasional até que o PFA é dissolvido. Girar partículas remanescentes e recuperar 20% PFA sobrenadante. Fazer o tempo todo fresco.
Prepare a solução de fixação contendo 1x fix tampão e 4% PFA.
Anestesiar os peixes em 0,17 mg / ml tricaina.
Usando a luz incidente sob um microscópio de dissecação arrancar escamas dorsais usando nítidas de ponta fina pinça, tomando cuidado para não danificar o meia melanócito contendo da escala (Figura 3A). Escalas local diretamente a pinça em uma solução de fixação ml e incubar à temperatura ambiente, ao girar, para ≥ 2 horas. Transfira o peixe em água de peixe e monitorar o peixe para confirmar a recuperação bem sucedida.
A lixívia melanócitos pigmentados lavar tabelas fixas em PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% de Triton X-100) 2 vezes durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 1 ml de solução alcalina feita recentemente contendo 0,4 ml de KOH a 10% e 0,15 ml de 30% de H ₂ O ₂ em 5 ml de dH ₂ O. Coloque em bloqueios parafilme ou boné para evitar que o gás de estourar os tubos abertos. Continuar até branqueamento pigmento é ido (10 min é típico) (Figura 3B, C). Lavar quatro vezes em PBST, durante 5 min à temperatura ambienteratura.
Bloco de, pelo menos, 30 min em solução de bloqueio feita de 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN _3, e 2% de soro de cordeiro. Deixar de fora NaN ₃ se desenvolver com a reação HRP.
Incubar com anticorpo primário em solução bloqueadora durante a noite à temperatura ambiente. Você precisa de ter, pelo menos, 400 ul de solução sobre as amostras para mantê-los submergidos.
Lave as escalas 3 vezes durante 30 min em PBST, à temperatura ambiente.
Incubar com o anticorpo secundário de 2 horas a durante a noite em solução de bloqueio à temperatura ambiente.
Mancha por 10 min com PBST DAPI uM + 0.1.
Lavar 3 vezes durante 5 min com PBST.
Montar as escalas em uma lâmina de vidro em uma gota de Vectashield de modo que o lado côncavo da balança está voltado para baixo no sentido da lâmina e colocar uma lamela de vidro sobre eles. Vedar as extremidades da lâmina com unha polonês clara e observar as lâminas num microscópio de fluorescência (Figura 3D, E, F, G ).

4. Transplante de Ensaio

Prepare destinatário 2-3 meses de idade casper ⁹ peixes através da irradiação com 25 Gy de radiação gama, um dia antes do transplante ^10. Permitir que os peixes se recuperar em peixes de água.
Euthanize um peixe portadores de tumor tal como previamente descrito (secção 2.2).
Cortar o tumor e colocá-lo em uma placa de Petri com aproximadamente 5 ml de filtro esterilizado 0.9x PBS com 5% de FBS. Dado o tumor com uma lâmina de barbear, enquanto em solução.
Trabalhar à temperatura ambiente, tritura-se com uma pipeta P1000 para obter células únicas. Perfazer o volume para 25 ml com filtro esterilizado 0,9 x PBS com 5% de FBS.
Filtrar através de filtro de 40 mesh uM.
Girar em uma centrífuga de bancada Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 rcf) durante 10 min.
Remover o sobrenadante e fazer a suspensão das células a uma concentração aproximadamente desejado (assume-se 10 ⁷ células de tumor de 100 mm ^3).
Calcular tele número exato de células utilizando um hemocitómetro e dilui-se a suspensão de células de modo a que o volume final de injecção é de cerca de 5 ul. Por exemplo, se a 50.000 células são para ser injectada, a suspensão de células deve ser diluído para uma concentração final de 10000 células / uL. Flick o tubo que contém a suspensão de células a cada poucos minutos para evitar aglomeração das células.
Lavar um calibre 26 (ponta cónica) 701 N 10 seringa Hamilton ul 2-3 vezes com etanol a 100% e 0,9 x PBS. Carregar a seringa com 5 uL da suspensão de células.
Anestesiar os peixes destinatário irradiado em 0,17 mg / ml tricaina. Coloque o peixe de lado sobre um Kimwipe húmido (Figura 4A).
Estabilizar os peixes com uma mão e inserir a agulha com o bisel voltado para cima em um ângulo de 45 ° no flanco do peixe acima da cavidade peritoneal a meio caminho entre o limite posterior do cérebro posterior e borda anterior da barbatana dorsal. Suavemente o êmbolo (Figura 4B).
Permitir que o peixe se recuperar a água de peixe fresco e observar o peixe por dia, durante o enxerto do tumor (Figura 4C). Se o enxerto tenha ocorrido, o crescimento continuado e o desenvolvimento da doença pode também ser observado.