Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Summary

Aqui apresentamos um método histológico para captura, rotulagem, opticamente limpar e imagem da interface tecido intacto cérebro em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral dos roedores. Os resultados das técnicas que compõem este método são úteis para a compreensão do impacto dos vários penetrantes cérebro-implantes em seu tecido circundante.

Abstract

A investigação sobre o design e utilização de micro-cérebro implantados, como matrizes de microeletrodos, visa produzir dispositivos clinicamente relevantes que interagem com o tecido circundante cronicamente cérebro. Tecido circundante destes implantes é pensado para reagir à presença dos dispositivos ao longo do tempo, o qual inclui a formação de um isolante "cicatriz glial" em volta dos dispositivos. No entanto, a análise histológica destas alterações do tecido é normalmente realizado após o explantar dispositivo, num processo que pode perturbar a morfologia do tecido de interesse.

Aqui demonstramos um protocolo em que os dispositivos implantados-corticais são recolhidos em torno intacto tecido cerebral dos roedores. Descrevemos como, uma vez perfundidos com fixador, os cérebros são removidos e cortados de modo a evitar a dispositivos explantar. Nós delineamos rotulagem anticorpo fluorescente e métodos de compensação óptica úteis para a produção de um tecido, informativo ainda grossasecção. Finalmente, demonstramos a montagem e imagiologia destas secções de tecido, a fim de investigar a interface biológica em torno cerebrais implantados dispositivos.

Introduction

O campo de pesquisa tem como objetivo neuroprótese para ajudar as pessoas que sofrem de várias deficiências e transtornos ignorando estruturas doentes ou danificadas no corpo através de interface SNC ^1,2 dispositivos. Microdispositivos Brain-implantados, tais como matrizes de microeletrodos (MEA), pode ser utilizado para gravar ou estimular as estruturas cerebrais e, assim, permitir o estabelecimento de longo prazo interfaces entre electrónica e tecido do SNC ^3-5. MEAs penetrantes, os dispositivos que são conduzidos para o tecido cerebral, em particular como uma promessa bidireccionais interfaces devido à proximidade em que se apresentam os eléctrodos a um conjunto relativamente pequeno de neurônios próximos ^6.

No entanto, as respostas complexo tecido resultam da implantação a longo prazo de MEAs penetrantes, muitas vezes resultando em variáveis ​​e gradualmente degradar electrofisiológicas sinal-para-ruído mais dias ou meses, e um aumento na impedância eléctricadade entre os sites de eletrodos e terra ^7,8. As origens putativas destas alterações incluem a activação de microglia, astrocitose reactiva ao longo dos microdispositivos, e uma perda ou migração de neurónios a partir do tecido circundante para dispositivos implantados ^9-11. Um grande desafio para a compreensão dessas alterações no tecido em torno crônicas AAM, a penetração é a dificuldade na captação de dados histológicos da interface tecido circundante intacto dispositivos cronicamente implantados ^12. A análise histológica do tecido com a interface do dispositivo / tecido ainda presente seria melhorar os atuais dispositivo de remoção de protocolos histológicas. Com um dispositivo sem perturbações restante no tecido, o impacto biológico das interacções relativamente subtis, tais como a utilização de revestimentos biocompatíveis ^13,14 ou a compensação eléctrica da superfície do eléctrodo, ^15,16 podem ser visualizados e analisados ​​em relação ao implante.

Here que demonstrar um método para coletar, processar e imagem da interface microdispositivo intacta por análise de microscopia baseada detalhada do tecido cerebral circundante. Neste método, o dispositivo e o tecido cerebral circundante são recolhidos dentro de uma secção de tecido espesso (> 250 um), utilizando um vibratome. Para melhorar a penetração do rótulo histológica para estas rodelas grossas, etiquetas fluorescentes histoquímicos e imuno-histoquímicos são aplicados em concentrações elevadas em soluções contendo soro de bloqueio e um detergente para vários dias. Uma solução de limpeza óptico é utilizado para melhorar a profundidade de imagem de microscopia, eo tecido é montado em dois lados para câmaras de laser subsequente por microscopia confocal ^17. Para capturar a interface completa histológica, uma fase controlada por computador é utilizado durante a translação de imagem para recolher z-stack panoramas ao longo do comprimento dos implantes. Além de imagens aplicadas etiquetas de tecido, a coleta de reflexão laser de volta a partir de implantese transmissão de luz através do tecido ajuda ambos localizar a interface do dispositivo em relação ao tecido circundante. Tecidos preparados com este "dispositivo de captura-Histologia" (DCHist) protocolo fornece acesso às imagens morfologia preservada tecido / dispositivo de interações e, assim, melhora a anteriores dispositivo de remoção de protocolos histológicos ^18.

Protocol

Soluções

Tampão fosfato salino (PBS) -, em g / l, 9 g de NaCl, 0,144 g de KH ₂ PO _4, 0,795 g de Na ₂ HPO _4, pH 7,4

O formaldeído a 4% - em ml / l; 202 ml de fosfato de sódio dibásico solução (0,4 M de Na ₂ HPO _4), 48 ml de fosfato de sódio monobásico solução (0,4 M NaH ₂ PO _4), 500 ml de solução de formaldeído a 8%, 250 ml de água Milli- Q DDi água, a pH 7,4

HEPES salino tamponado de Hank com azida de sódio (HBHS) -, em g / l, 7,5 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,06 g de KH ₂ PO _4, 0,13 g de Na ₂ HPO _4, 2 g de glucose, 2,4 HEPES g, 0,05 g _de MgCl2 6 partes de H ₂ O, 0,05 g de MgSO ₄ 7 partes de H ₂ O, 0,165 g _de CaCl2, 0,09 g _de NaN3, pH 7,4

Solução de Lavagem (WS) - 1% vol / vol, nemsoro de cabra normal, 0,3% de Triton X-100, em HBHS com azida de sódio _(NaN3). Refrigerar a WS a 4 ° C antes da sua utilização nos passos subsequentes.

U2 Sca l Solução e - ureia 4 M, glicerol a 30% e 0,1% de Triton X-100 ¹⁷

PROCEDIMENTO

Todos os experimentos foram realizados sob a supervisão da Animal Care Purdue e do Comitê do Programa de Uso e Animais de Laboratório da Universidade Purdue.

1. Cirurgia

1. Vários métodos cirúrgicos assépticos são compatíveis com o método apresentado histológica. O uso de uma armação estereotáxica e inserters automatizados são recomendados para melhorar a reprodutibilidade e controlo das matrizes de microeletrodos (MEA) Ângulo de implante em relação aos planos estereotáxicas.

Nota: Nesta demonstração o nosso método cirúrgico é a seguinte: manter o sujeito em roedor estereotáxico earbars while sob anestesia isoflurano (entre 1-3%) realizadas pelo oxigênio da classe médica. Teste para a falta de um dedo do pé pinch-reflectir no rato ou a falta de um reflexo de aperto da cauda no ratinho para confirmar que o animal é completamente anestesiada. Aplicar pomada e limpar o local da cirurgia, com três lavagens alternadas de Betadine e álcool. Lavar as mãos, luvas cirúrgicas, hairnet madrugada, máscara e bata. Injetar um bolus de Lidocaína para anestesiar a área cirúrgica, criar uma incisão com tesoura ou periósteo, bisturi claro com raspador de osso e aplicadores de algodão, e criar uma craniotomia usando uma peça de mão broca de dentista e broca. Dirija um MEA haste única para o córtex usando um micromanipulador. Ter uma ajuda assistente cirúrgico para manter condições cirurgia asséptica e documentar o andamento da cirurgia.

2. Após a implantação da MEA no cérebro, recolha de imagens por meio de um microscópio cirúrgico, para informar a eventual remoção do crânio a partir de em torno do bchuva. Porções dos dispositivos implantados serão preservados in situ.

Nota: A recolha eventual de tecido com os dispositivos in situ baseia-se no que segue de perto o plano da inserção do dispositivo com o plano de seccionamento de tecidos. Notas detalhadas sobre o plano de inserção do dispositivo em relação ao cérebro, são, portanto, muito importante.

3. Após o procedimento, aplique o elastômero de silicone Kwik-Sil (WPI), em torno de todo exposto MEA hastes ou cabos, e deixar curar. A peça de plástico esterilizado, tal como uma ponta de pipeta de corte, pode ser usado para ajudar a conter o elastómero de silicone em um pequeno poço em torno da craniotomia enquanto cura.
4. Aplique uma camada de duas partes em acrílico dental ("Liquid Jet" e "Pó Jet" de Lang Dental) sobre o Kwik-Sil e qualquer crânio exposto.

Nota: Num passo posterior, o headcap vai ser derretido através de permitir que o implante seja separadoa partir do crânio. De cura UV acrílico devem ser evitados durante a Kwik-Sil e craniotomia, como esta acrílico duro é difícil de remover mais tarde. Materiais com visual opaco ao redor do implante também devem ser evitados; clara Kwik-Sil fornece uma visão do implante durante as etapas subseqüentes deste protocolo.

5. Realizar procedimentos de cuidados pós-operatórios de acordo com o protocolo local dos regulamentos bem-estar animal, e retornar assuntos ambulatoriais a única alojados gaiola-boxes.

2. Perfusão e coleta de tecido

Nota: Veja Gage et al. para um passo a passo detalhado de perfusão procedimento no modelo animal de ratos ^19.

1. Use a anestesia e perfusão protocolo aprovado pelo cuidado da instituição animal e comitê de uso. Após profundamente anestesiar o roedor (confirmado por uma falta do dedo pinch-reflexo em ratos ou cauda pinch-reflexo em camundongos) e expor o coração, fazer cortes rasos de tesoura empara o ventrículo esquerdo e átrio direito. Inserir uma agulha romba para dentro do ventrículo esquerdo e entregar temperatura ambiente PBS. Fornecer um total de ~ 10 ml de PBS a ~ 5 ml / min, em ratinhos, e ~ 200 ml de PBS a ~ 100 ml / min, em ratos. Olhe para depuração do sangue do fígado durante.
2. Injectar etiquetas químicas relevantes transcardially histologicamente, se assim for desejado, por entrega de seringa com o cuidado de evitar a introdução de bolhas de ar.

Nota: As etiquetas vasculares (por exemplo, dii) e corantes de ácidos nucleicos, por exemplo, para contraste (Hoechst 33342) são exemplos de etiquetas químicas administráveis ​​durante a perfusão. Quando administrado corretamente, esses marcadores histológicos deve rotular o animal inteiro ^20.

3. Entregar temperatura ambiente tamponado, formaldeído 4% transcardially para fixar o animal. Evitar perfuração do septo através do coração, que pode ser evidenciado pelos pulmões nariz de drenagem durante a perfusão. Procure por tremores de fixação nos grandes músculospara indicar a perfusão completa. Fornecer um total de ~ 10 ml de fixador em ~ 5 ml / min, em ratinhos, e ~ 200 ml de fixador em ~ 100 ml / min, em ratos.
4. Na sequência de perfusão, decapitar o animal, expor parte do tronco cerebral ou cerebelo usando fórceps, tesouras, e cabeça lugar em solução de formaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C.
5. Lava-se a cabeça em três mudas de PBS com um a quatro horas de intervalo entre as lavagens.
6. Armazenar as cabeças fixas em HBHS contendo azida de sódio a 4 ° C durante dias a meses.

3. Remoção cérebro com Dispositivos situ

Nota: Execute esta seção em uma coifa enquanto usava equipamento de proteção individual. Evitar a dessecação dos tecidos, devolvendo a cabeça fixa para HBHS solução periodicamente.

1. Dissecar cuidadosamente afastado pele e outros tecidos de todo o gorro acrílico com pinças e tesouras pequenas.
2. Quando estiver usando o calor-iluvas nsensitive, utilizar um ferro de solda para remover acrílico dental e expor uma área de subjacente claro Kwik-Sil (Figura 2a).

Nota: O objectivo deste passo é o de permitir que os micro-tesouras um ângulo adequado de acesso a posições em que os dispositivos implantados entram no cérebro, de modo que os componentes implantados cerebrais pode ser separado a partir de componentes fixados ao crânio.

3. Sob um microscópio cirúrgico, cortado em elastómero de silicone com curvas micro-tesoura, removendo pequenos pedaços de Kwik-Sil, com uma pinça para baixo para a posição em que os dispositivos de entrar no cérebro.
4. Continuar o corte ao longo da superfície da craniotomia com curvas micro-tesoura para separar componentes do dispositivo ligados a silício policristalino e do crânio a partir de componentes implantados no cérebro. Mais uma vez usar a ampliação microscópio e muito cuidado ao cortar as componentes do dispositivo expostos, tomando cuidado para evitar empurrando ou arrastando o implants no tecido fixado.
5. Remover o osso ao redor do headcap com cuidado usando fórceps. Usar uma espátula para separar o cérebro com os dispositivos implantados no crânio. Guarde o cérebro em solução HBHS até estar pronto para cortar.
6. Colocar o cérebro de uma placa de Petri de vidro cheio de HBHS, e utilizar uma lâmina de barbear para remover tecidos estranhos, tais como medula, cerebelo, bulbo olfativo ou, dependendo de se são relevantes para o local de implantação do dispositivo. Usar um bloco cérebro (Ted Pella) e lâminas de barbear para a secção do cérebro e criar uma superfície plana que segue de perto o ângulo dos dispositivos implantados, o que é conseguido através da colocação do cérebro em um bloco de cérebro de tamanho apropriado, orientando o cérebro de tal modo que qualquer porção visível do implante é paralelo com a guia de lâmina de barbear, e a colocação de uma lâmina de barbear de uma lâmina de guia de pelo menos 2 mm a partir do implante. Pressionar a lâmina através do tecido. Montar esta superfície para uma plataforma de vibratome. Alternarespectivamente, uma lâmina de barbear montada de um micromanipulador pode ser usado de uma forma semelhante como o controlo de bloco cérebro para criar um plano que segue de perto a direcção do implante.
7. Lugar de gelo sob a plataforma vibratome, e, depois de permitir que a superfície do tecido para secar brevemente sobre uma toalha de papel, aderir o cérebro para um vibratome usando Super Glue. Cola ao plano do tecido liso criado na etapa anterior é o estágio. Com as dimensões de tecido assimétricos, orientar a amostra de tal modo que a maior dimensão é colado para baixo em paralelo com a direcção do movimento da lâmina de vibratome para ajudar a evitar que a lâmina potencialmente batendo o tecido acabado. Depois dos conjuntos de cola (~ 1-2 min), adicionar gelada (~ 4 ° C) ao prato de PBS vibratome em torno do tecido.
8. Colete fatias de tecido de espessura entre 200-400 pm, incluindo o tecido de controlo, utilizando a taxa de vibração máxima (~ 100 Hz) e uma taxa de progressão lenta da lâmina (<0,2 mm por segundo), com um ângulo da lâmina de 10 ° a partir de horizontal. Colete fatias cuidadosamente com uma espátula de escova ou colher e armazenar em HBHS em uma placa de 24 poços a 4 ° C.
9. Uma vez que o dispositivo em situ é visível a olho nu ou um microscópio cirúrgico, recolher as secções mais finas para se aproximar do dispositivo em incrementos de fatias de 100 um ou menos.

Nota: típicos de silicone micro-implantes são visíveis a olho nu em formaldeído fixo tecido do córtex cerebral de roedor, entre 300 e 500 um a partir da superfície do dispositivo.

10. Com o dispositivo em situ agora próximo da superfície do tecido, recolher uma fatia de tecido> 250 um, contendo o dispositivo de dentro. Estimativa da espessura necessária pode ser auxiliada por referência fatias previamente recolhidas.

Nota: Os dispositivos maiores, dispositivos multidentes e dispositivos angulares podem exigir cortes mais finos de tecido (> 500 um) para capturar o dispositivo de uma só peça de tecido; remembro que tanto a penetração de rótulos aplicados ea profundidade imagens de microscopia será limitado na coleta de dados eventual dessas fatias muito grossas. Se possível, evitar a colidir com o dispositivo, com a lâmina vibratome, pois pode provocar a arrastar do dispositivo através da deformação do tecido e morfológicas.

4. Processamento de tecidos e de Compensação

1. Lavar 3x em fatias de 5 minutos por lavagem em HBHS
2. Incubar em borohidreto de sódio (5 mg NaBH _4/1 ml de HBHS) para 30 total min (15 min cada lado da fatia). Virar as fatias usando um aço inoxidável ou Teflon colher revestido de micro e pequeno pincel (Ted Pella). Movimentos lentos e pensativo melhorar o sucesso de cada flip fatia. Evite tocar em todas as áreas em torno do dispositivo implantado com a escova. Quando possível, adicionar a solução de significativamente mais do que o necessário (> 2 ml) permite manipular e virar as fatias de tecido mais facilmente.

Nota: Esta etapa reduz endógena autofluorescência; pular esta etapa se etiquetas fluorescentes foram aplicados durante a perfusão ou XFP marcadores transgênicos estão presentes.

3. Lavar 3x em fatias de 5 minutos por lavagem em solução de lavagem à temperatura ambiente.

Nota: agitação durante as etapas de lavagem e de incubação é opcional. Os autores especulam que subtil brusco do implante rígida em relação ao tecido cerebral circundante pode ocorrer com agitação. No entanto, um misturador orbital em movimento a uma velocidade suave (

4. Bloquear, durante 2 horas em solução de lavagem à temperatura ambiente (fatias aleta depois de uma hora).
5. Incubar em anticorpos primários (diluído em solução de lavagem) durante cerca de 48 h (24 h de cada lado da fatia) a 4 ° C.
6. Executar 6 3 lavagens rápidas min com a solução de lavagem.
7. Executar 6, 1 hora (3 lavagens lavagemes em cada lado da fatia de tecido), em solução de lavagem (armazenar a 4 ° C durante a noite, se lavar).
8. Incubar em anticorpos secundários (diluído com solução de lavagem) durante cerca de 48 h (24 h de cada lado) de 4 ° C.
9. Executar 6 3 lavagens rápidas min com a solução de lavagem.
10. Executar 6, 1 hr lavagens (3 lavagens de cada lado) na solução de lavagem; armazenar a 4 ° C durante a noite, se lavar.
11. Remover Solução de lavagem e adicionar o glicerol-based "U2 - Sca l e" solução de compensação. Permitir a limpar a cerca de 1 semana para rodelas grossas (250-500 um) ou 2-3 semanas para as secções de tecido de grande espessura (> 500 um), a 4 ° C.
12. Cobrir a placa com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C.
13. Montar em lâminas acomodando cortes de tecidos de espessura (Figura 2b, 2c) usando uma solução de limpeza como meios de montagem e selagem com unha polonês claro. Armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz.

5. Panorama Imagem de Full TiInterface de ssue e Dispositivo

1. Usando mais-trabalho objetivos distância microscópio (> 2 mm), começam imagem com um laser microscópio confocal ou dois fótons microscópio. Nós vamos demonstrar com um LSM Zeiss 710, lente Carl Zeiss software "Zen" (2010), e um estágio XY controlada por computador traduzindo a imagem de um panorama 3D em torno de um implante.

Nota: correto para o índice de refração da solução de limpeza ou em software, através de uma coleira corretiva sobre o objectivo, ou em processamento de dados após a coleta. Nesta demonstração entramos em um valor de índice de refração para a solução de compensação "U2" de 1,4 para o software Leica microscópio Zen; esta definição sutilmente ajusta z-passo intervalos para contabilizar incompatibilidade índice de refração.

2. No tecido perto do dispositivo, cerca de avaliar as apropriadas do eixo z definições da janela e coleta de dados do z-dimensão para cada canal fluorescente usando laser de baixa potência (~ 00,5-5%) e grandes z-passo tamanhos (> ^ M 25).

Nota: Inclua um espaço adicional acima e abaixo ao definir o eixo z ao configurar a coleta de dados panorâmica, como o tecido não pode ficar inteiramente plana no vidro do carro (~ 20 um em cada direção).

3. Estabeleceu o objectivo no centro xy do panorama eventual, usando o software panorama Zen, determinar o número de posições de coleta necessários para cada eixo (X e Y) para cobrir a sua região de interesse.
4. Reavaliar e finalizar a coleção janela eixo z.
5. Definir manualmente a sensibilidade do detector de potência de laser e a rampa de forma adequada com maior profundidade, o objectivo é, tipicamente, de manter aproximadamente o mesmo a intensidade da imagem, independentemente da profundidade de imagem na direcção da fatia de tecido, mas também para evitar o ruído de fundo elevado.
6. Recolher cada imagem fluorescente série de dados. Se necessário, para evitar a sobreposição de sinais, executar linha de lasers seqüencialmente.

Nota: Se estiver disponível, ajustar o software para salvar automaticamente os dados para o disco rígido durante a coleta.

7. Altere as configurações de software para coletar o "reflexão" e "transmitância" de dados, e usar um mais longo, comprimento de onda mais penetração (por exemplo, 633 nm) para captar esses canais. Determinar a potência do laser apropriado e sensibilidade do detector de "reflectância" e "transmitância" recolha e repetir a mesma série recolha em torno do dispositivo implantado.
8. Exportar os dados para posterior processamento, quantificação e análise.

Results

MEAs Brain-implantados podem ser recolhidos em fatias de tecido, primeiro pela separação quaisquer componentes crânio montado a partir dos componentes do cérebro incorporados. Figura 2a mostra os resultados da remoção de um dos lados de um headcap cimento dentário e uma porção do Kwik-Sil em torno de um cabo de MEA num crânio de ratos. Um ferro de soldar foi utilizada para remover o cimento dental e Kwik-Sil numa hotte. A cablagem e quaisquer estruturas não-MEA foram implantados próximo cortado com micro-tesouras por escavação lentamente através do Kwik-Sil para baixo para a superfície do cérebro fixo.

Após corte, etiquetagem e limpeza de tecidos, simples feitos por lâminas são úteis para a montagem das fatias de tecido de espessura (Figura 2b). Uma fatia de cérebro montado que contém um microdispositivo implantado é mostrado na Figura 2c. Imagiologia através de qualquer um dos lados da lâmina pode permitir-lhe avaliar a interface em torno de um dispositivo, tal como demonstrado na Figura 3 (Figura 3a) e ao longo de microglia sítios de eléctrodos e vestígios visíveis do outro lado (Figura 3b).

Uma vez montado, o tecido pode ser visualizado utilizando um estágio de translação XY. Sínteses das etiquetas fluorescentes através fatias de tecido inteiro pode ser gerado com a resolução desejada (Figura 4). A análise detalhada do interface tecido morfologicamente conservados em torno de microdispositivos implantados podem ser recolhidos sob a ampliação elevada para a análise da resposta do tecido local (Figura 5).

Figura 1. Visão geral de procedimento. (AC) do cérebro micro-implante cirurgias são finazados com uma camada de polímero Kwik-Sil que rodeia imediatamente o dispositivo, seguido de um revestimento acrílico. (D, e) Após a eutanásia, a camada acrílica é queimado, e crânio-montados componentes do dispositivo são separados dos componentes implantados por corte através do elastómero de silicone. (F, g) O cérebro é então removido a partir do crânio e é cortada e montada na fase vibratome. (Hk) fatias de tecido são recolhidos, incluindo uma fatia de tecido que contém o dispositivo. (L) tecido pode então ser processado e montado em câmaras personalizados para microscopia detalhada. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. (A) Limpar Kwik-Sil su elastômero de siliconerrounding um cabo de eletrodo array (seta) foi exposta através da queima de distância de uma janela na tampa de cimento dentário em uma cabeça roedor perfundido usando um ferro de soldar. (B) Para acomodar imagens em ambos os lados de uma fatia de tecido grosso, simples "slide-câmaras" pode ser feito cortando um slide de plástico e aderindo lamela de cada lado em torno do tecido e solução de montagem. (C) Um rato fatia de tecido cerebral com o implante intacto (seta vermelha) é mostrada após a montagem. Ambos os lados do tecido é rapidamente acessível a imagens de microscopia com esta configuração. Para a escala, painel (a) é de 25 mm de diâmetro, na parte inferior, enquanto que os painéis (b, c) é de 80 mm de diâmetro, na parte inferior.

Figura 3. Int Máximaensity z projecções de 40 um de espessura, pilhas de imagens recolhidas em torno da parte traseira (a) e frontal (b) de uma matriz de microeletrodos implantados. Microglia (marcado com anti-Iba1 e Alexa Fluor 633, branco) e laser de reflexão de luz (vermelho), recolhidas a partir da superfície do dispositivo, foram sequencialmente trabalhada a partir de ambos os lados de uma fatia de tecido 400 um de espessura. À medida que os implantes cerebrais são muitas vezes opacos, montagem com acesso óptico de ambos os lados permite uma visão clara de estruturas de tecido marcados "por trás" do implante em relação ao objectivo do microscópio. Barra de escala 50 mm.

Figura 4. Uma fatia DCHist rotulado fotografada usando um estágio controlado por computador em um microscópio confocal a laser. (A) núcleo celular (corados com Hoechst 33342) e (b) os monócitos / microglia(Marcado com anti-Iba1) foram simultaneamente fotografada em canais separados. (C) A transmissão e reflectância de luz também foram recolhidos, mostrando a localização do implante de 4 semanas em relação a Hoechst e Iba1 dados. (D) sobreposição de todos os canais de transmissão, mas também é mostrada. A área do retângulo branco é ampliado em imagens que aparece à direita. Barra de escala de 1 mm.

Figura 5. Usando um microscópio de fase controlada por computador e software apropriado, os dados de imagem panorâmica pode ser recolhido em torno do implante. Reflectância (a) e de transmitância (b) permitir a localização do dispositivo, enquanto que as etiquetas fluorescentes anticorpos ou químicas (c, anti-Iba1 rotulagem de microglia e macrophages) permitir imagens detalhadas dos componentes do tecido ao longo da interface do tecido intacto. Barra de escala de 200 um.

Discussion

O "dispositivo de captura-Histologia" método (DCHist) demonstraram aqui permite a avaliação histológica perto de interações morfologia preservada entre o tecido cerebral e implantes de tecidos. Recolha de tecidos DCHist requer a separação cuidadosa dos componentes montados no crânio do dispositivo a partir de componentes implantados no cérebro. DCHist também exige a coleta de uma fatia de tecido grosso histológico (> 250 mm). Estes cortes de tecido, uma vez rotulado, limpo, montado, e com imagens, pode fornecer informações novas para a implantação ou lesão resposta crônica após a dispositivos de longa permanência. Usando ferramentas avançadas de microscopia, a interface entre o tecido e o dispositivo pode ser trabalhada e analisada em grande detalhe, como mostrado nas Figuras 3-5.

As técnicas apresentadas na sua forma actual contam com a capacidade de, lentamente, embora a escavar headcap feita a partir de duas partes de cimento dentário e Kwik-Sil para baixo para o ponto de implantação do dispositivo.Utilizando cimento dental que pode ser gravado ou de outro modo removida para longe e um elastómero de silicone transparente através da qual pequenas tesouras pode ser guiado visualmente auxiliar muito sucesso em separar o dispositivo implantado a partir dos seus componentes montados no crânio. A tentativa de cortar o dispositivo sob o crânio acima do cérebro e, a fim de recolher lo in situ não é recomendado, porque o implante crânio montado irá ser puxado para fora do cérebro, de uma quantidade significativa.

Embora mais finos, implantes menores, tais como AAM haste individuais de NeuroNexus, são mais passíveis de DCHist, os princípios não estão restritos a hastes de dispositivos individuais ou matrizes de microeletrodos. Recolha e estratégias de imagem são amplamente aplicáveis ​​a haste multi-dispositivos e implantes maiores, tais como cânulas, com os requisitos é que eles devem ser separados a partir de qualquer montagem do crânio e recolhido dentro de uma secção de tecido de espessura. Embora os autores estão focados na análise do tecidocircundantes implantes corticais, dispositivos movidos mais fundo no cérebro também pode ser recolhida e trabalhada. A profundidade de inserção do implante não deve afectar a captura do implante de uma fatia, desde que o dispositivo não se desviar muito de o ângulo de inserção conhecidas.

Existem limitações à aplicação útil do método DCHist. Seções de tecido cerebral são difíceis de imagem através de centenas de micrômetros, especialmente nas áreas de substância branca, embora as soluções de compensação óptica pode melhorar muito profundezas de imagem em vários tecidos ^21. Para melhorar ainda mais a profundidade de imagem, de dois fotões microscopia de excitação podem ser empregues juntamente com a limpeza óptica descrita.

Outra limitação potencial do método descrito podem ser os métodos específicos e anticorpos imuno fluorescentes utilizados pelos investigadores. Difusão passiva normalmente dirige a incorporação destes marcadores através de tecido fixadoe em sites de ligação a antígenos. As concentrações finais de anticorpo de trabalho deve ser determinada por investigadores numa base caso a caso para maximizar a penetração da etiqueta, evitando níveis elevados de etiquetagem de fundo. Rotulagem de anticorpos não deve ser variável entre fatias que são processados ​​de forma idêntica, mas de diferentes anticorpos podem variar consideravelmente na sua capacidade de penetrar e marcar o seu antigénio, com alguns anticorpos facilmente etiquetar antigénios muitas centenas de micrómetros de profundidade e de outros antigénios de etiquetagem apenas dezenas de micrómetros de profundidade. Descrevemos melhorar esta difusão por aplicação de etiquetas de anticorpos em concentrações superiores típicos, com vários dias de aplicação, e de uma solução contendo detergente diluído e bloqueio de soro. Periodicamente lançando as fatias também promove ainda rotulagem. Passos de recuperação de antigénio e os processos de fixação adicionais (por exemplo glutaraldeído microondas, etc) pode ser adequado para antigénios específicos. Anticorpo secundário fluoroch-conjugados roma pode também variar no seu desempenho rotulagem de espessura, embora isto não tenha sido observado pelos autores usando rótulos de Alexa Fluor da Invitrogen. Alternativamente, os indivíduos animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em tipos de células de interesse pode ser utilizada para evitar problemas com a penetração etiqueta de anticorpo, tal como muitas proteínas fluorescentes, tais como eGFP, conservam a sua fluorescência após tratamento com formaldeído, e pode ser imediatamente visualizado em secções de tecido.

DCHist é um poderoso conjunto de técnicas para capturar e analisar o impacto de microdispositivos implantados no tecido cerebral. Acoplamento este protocolo histológico com in vivo de avaliação de qualidade e de eletrofisiologia de dados de eletrodos de impedância ²² poderia melhorar muito a nossa compreensão das fontes biológicas de variabilidade fisiologia e degradação. O campo de dispositivos implantados protéticos neurais em particular, podem beneficiar com a detalhada DCHist imaging da interface de dispositivo / tecido intacto para informar um maior desenvolvimento de dispositivos biologicamente neutros MEA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagentes
Hoechst 33342	Invitrogen	14533	DNA marcador
Coelho anti-Iba1	Wako (Japão)	019-19741	Anticorpo monócitos
Acrílico dental	Lang Dental (vários distribuidores)	Jet Pó Reparação Prótese e líquido	Headcap construção
Kwik-Sil	Instrumentos de Precisão mundo	KWIK-SIL	Cobrindo expostos implantes cranianos
Soro normal de cabra	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Processamento de tecidos
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Processamento de tecidos
Uréia	Sigma-Aldrich	U4883	Limpando solução
Glicerina	Sigma-Aldrich	G20225	Limpando solução
			Equipamento
Curvas micro-tesoura	Instrumentos de Precisão mundo	14208	Corte implante antes de remover cérebro
Giletes	Ted Pella	(Vários tamanhos)	Para utilização com o bloco Cérebro
Acrílico Cérebro Matrice	Ted Pella	15054	Bloco cérebro para criar plano inicial no tecido
Lâminas de plástico	Ted Pella	260225	Tecido de montagem
Tampa de vidro	Ted Pella	(Vários tamanhos)	Tecido de montagem
Matrizes de eletrodos	NeuroNexus	(Vários modelos)	AAM exemplo
Vibratome	Leica	VT1000 S	Sistema específico usado no método apresentado
Lâminas Vibratome	(Vários fornecedores)		Coletar fatias
Placas de 24 poços	(Vários fornecedores)		Armazenamento e processamento de fatias de tecido
Microscópio confocal com estágio motorizado XY-varredura	Carl Zeiss Microscopy	Software Zeiss LSM 710 e '2010 Zen'	Sistema específico usado no método apresentado
Ferro de solda	(Vários fornecedores)		Escavação headcap