Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.
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Artigo de método
Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós demonstramos a utilização de uma configuração de microfluidos simples, no qual as células de levedura de brotamento individuais podem ser rastreados em todo o seu tempo de vida. O chip de microfluídica explora a diferença de tamanho entre as células mãe e filha usando uma matriz de micropads. Após a carga, as células são presos debaixo destas micropads, porque a distância entre o microPad e tampa de vidro é semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura (3-4 mm). Após o procedimento de carregamento, meio de cultura é continuamente perfundido através do chip, o que não só cria um ambiente constante e definida ao longo de toda a experiência, mas também elimina as células filhas emergentes, que não são retidas por baixo das almofadas, devido ao seu menor tamanho. A configuração retém células mãe tão eficientemente que numa única experiência de até 50 células individuais podem ser monitorizados de um modo totalmente automático, durante 5 dias, ou, se necessário, mais longo. Além disso, as propriedades ópticas excelentes do chip permitir altaResolução de imagem de células durante todo o processo de envelhecimento.
Introdução
Brotação de levedura é um organismo modelo importante para o envelhecimento investigação 1. Até recentemente, o estudo de envelhecimento replicativo em células de levedura era um processo laborioso que requer um método de esvaziamento, em que cada botão era removido manualmente a partir da célula mãe 2,3. Para resolver este problema, que recentemente apresentou um novo configuração microfluídicos capaz de rastrear células mãe individuais ao longo de toda sua vida útil 4.
Em nosso chip de microfluídica, células de levedura são presos sob micropads suaves à base de elastómeros (ver Figura 1). Um fluxo contínuo de meio de lava filha células recém-formadas e fornece as células com nutrientes frescos. Numa única experiência, até 50 células-mãe pode ser monitorizado de uma maneira completamente automatizada em todo o seu tempo de vida replicativo. Devido às excelentes propriedades ópticas do chip de microfluidos, é possível monitorizar simultaneamente diferentes aspectos da biologia das células de levedura (por exemplo, usando proteínas fluorescentes).
Comparado com o método clássico de dissecção, a configuração de microfluidos proporciona vantagens substanciais. Ela garante um ambiente definido e constante durante todo o experimento de envelhecimento. Não requer nenhum equipamento especializado caro e pode ser executado em qualquer microscópio equipado com foco automático e capacidade de lapso de tempo, bem como de controle de temperatura para o cultivo celular. A produção e operação dos chips microfluidicos podem ser aprendidas dentro de poucos dias. Além disso, as células podem ser carregadas directamente a partir de uma cultura em crescimento exponencial, uma vantagem sobre um outro método de microfluidos recentemente publicado em 5, que requer a biotinilação das células-mãe. Combinado com uma imagem de alta resolução, o método aqui descrito pode ser usado para medir as alterações graduais na morfologia celular, expressão de proteína de levedura e localização durante o envelhecimento de uma forma sem precedentes. A capacidade paramonitoramento de longo prazo de células individuais também oferece possibilidades únicas para estudos do ciclo celular de levedura.
um Este método foi recentemente optimizado para remover a biotinilação do protocolo de 16, que foi publicada durante este manuscrito foi em avaliação.
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Protocolo
1. Produção e Elaboração de um Wafer molde de silicone
Chips microfluídicos são criados a partir de um molde de wafer de silício produzidos por litografia macia. Essas pastilhas podem ser reutilizadas muitas vezes para produzir chips microfluidicos. É aconselhável que a produção de um respectivo bolacha é realizada por um grupo especializado em microfluidos 6.
A bolacha é feito num processo de duas etapas de fotolitografia usando duas camadas diferentes de material fotosensitivo negativo, SU-8 7. A camada inferior é usada para gerar a área de captura da célula (SU-8 2002; altura de 3-4 mm), enquanto que os canais são feitas com a camada superior (SU-8, 2010, altura 10 mm). Uma impressão de o processo de produção da bolacha pode ser encontrado em Huang et al 8. Os desenhos das fichas microfluidicos podem ser obtidos a partir dos autores, bem como aconselhamento sobre como obter uma respectiva bolacha.
- Uma vez que o wafer é obtido, corte um pedaço de Tough-Tag intÕ tiras finas de cerca de 0,5 milímetros por 3 mm com um bisturi e colocá-las cuidadosamente sobre a bolacha ligeiramente por cima da estrutura de canal entre os canais de entrada de ar e a matriz microPad (Figura 2A). Isto irá resultar na formação de um grande canal adicional em cada chip, o qual não irá ser utilizado apenas durante o carregamento da célula, mas também é importante para o funcionamento estável do dispositivo de microfluidos.
- Cobrir a placa de Petri de vidro com uma camada dupla de papel alumínio e colocar a hóstia na placa de Petri. A folha de alumínio irá impedir PDMS de correr entre a pastilha e a placa de Petri. Se PDMS faz fluência entre a bolacha e o prato de Petri de vidro, a bolacha será fixado permanentemente na caixa de Petri. Embora a bolacha é ainda útil, não será possível a substituição da placa de Petri de vidro, se rompe e o PDMS necessita ser cortada posteriormente.
2. Produção de chips microfluídicos
- Coloque um plástico vaziocopo na balança e tarar a balança. Despeje 40 g PDMS de base para o copo de plástico (para vidro de 12 cm de diâmetro placa de Petri). Adicionar o agente de cura de PDMS com uma pipeta descartável em relação a W / W de 01:10, isto é, cerca de 4 ml.
- Misture o PDMS e agente de cura cuidadosamente durante alguns minutos. Isto pode ser feito com a pipeta de plástico descartável, que foi usada para pipetar o agente de cura. É importante que a mistura é bem misturada antes da sua utilização na parte superior da bolacha. Pobre mistura fará com que parte do PDMS não polimerizar.
- Deite o PDMS no topo da bolacha na placa de Petri de vidro.
- A mistura de PDMS com o agente de cura vai originar a formação de espuma na mistura de PDMS. Estas bolhas precisam de ser removidos antes que o PDMS polimeriza. O PDMS pode ser desgaseificado depois vertendo-a no topo da bolacha, colocando a placa de Petri num exsicador ligado a uma bomba de vácuo. Com esta configuração, que leva cerca de 30 minutos para remover todas as bolhas a partir da mistura.
- Polimerizar ªPDMS e colocando a placa de Petri com a bolacha no topo de uma chapa quente a 120 ° C durante 1 hora e, em seguida, a 65 ° C durante mais uma hora.
- Remover a película de alumínio em conjunto com a bolacha e polimerizada PDMS da placa de Petri de vidro. Retire a folha de alumínio e a camada residual de fina polimerizada PDMS da parte traseira da bolacha. A camada de PDMS no topo da bolacha pode então ser separado da bolacha, levantando-a cuidadosamente.
- Coloque a camada de PDMS de cabeça para baixo (com os canais voltados para cima) no banco e cortar os únicos designs de chips impressos no PDMS cuidadosamente com um bisturi. Tentar reter cerca de 3 mm de PDMS em torno das bordas dos canais para melhorar a fixação do chip para o vidro de cobertura mais tarde.
- Faça furos no PDMS nas extremidades do canal de entrada, saída e lateral (Figura 2A), empurrando um esboço Luer 20 Medidor de todo o caminho através do PDMS de forma reta.
Certifique-se de que o chip PDMSainda está deitado de cabeça para baixo no banco, enquanto perfuração dos furos. Isto impede que o PDMS colem ao interior do canal, o que poderia causar o bloqueio do canal.
- Depois de perfurar cada buraco, retire a coluna de PDMS na ponta Luer com uma pinça antes de puxar a ponta novamente. A coluna PDMS poderiam ficar para trás e bloquear o buraco apenas um soco.
- Limpar as superfícies do chip de partículas de poeira e de PDMS residual colocando uma fita adesiva sobre ela e removendo imediatamente a fita de novo. Da mesma forma limpar a tampa de vidro para que o chip vai ser anexado.
- Coloque o chip limpo e tampa de vidro abaixo da lâmpada UV da bancada UV-Ozônio Cleaner. Os lados que precisam ser ligadas entre si deve enfrentar a lâmpada.
- Expor o PDMS e cobrir de vidro para a luz UV durante 6-8 min e imediatamente depois colocar o chip na tampa de vidro, colocando as superfícies expostas em cima uns dos outros.
- Bata levemente em torno dos lados do chippara promover a fixação do PDMS para o vidro de cobertura e para remover quaisquer bolhas de ar. Não toque no topo da estrutura do canal, pois isso pode fazer com que os micropads se apegar à tampa de vidro também.
- Coloque a configuração microfluídico recentemente feito numa placa quente a 100 ° C durante 60 min. Teste da força da ligação entre a cobertura de vidro e chip PDMS pela tentativa de levantar as bordas do chip de PDMS ligeiramente. Quando o bloco de PDMS não pode ser levantado da superfície do vidro, a ligação é bem sucedido e o chip está pronto para uso.
3. Preparando o Chip para celular Loading
A falha de um dispositivo de microfluidos pode potencialmente provocar uma fuga do meio no microscópio. Para evitar isso, é assessor utilizar um suporte de metal e / ou vedar os lados do chip em que o PDMS encontra o vidro com a unha polonês ou cola epóxi. Isto evita a fuga de meio, no caso do chip de PDMS não é suficientemente bem ligados à tampa de vidro. Além disso, a tubagemligações pode ser fixado em torno dos pontos de inserção de um modo semelhante, para evitar fugas de meio. Um sensor de água caseiro que desliga a bomba de seringa, em caso de vazamento pode ser usado como uma medida de segurança extra. Desenhos do suporte de metal concebida especialmente para o chip de microfluidos podem ser obtidos a partir dos autores.
- Coloque o chip de microfluídica no suporte de metal, com gel de silicone entre o vidro do chip e nas partes metálicas do suporte para criar um selo à prova d'água. Parafusar as porcas delicadamente, para não quebrar o vidro.
- Ligação de tubos finos (cerca de 5-15 cm de comprimento) para o canal lateral e o canal de saída do chip. O uso de pinças torna mais fácil inserir os tubos nos orifícios perfurados.
- Encher uma seringa de 50 ml de Luer-Lok com meio de cultura, remover o ar da seringa e ligar sequencialmente a um filtro de seringa, um topo de Luer 20 calibres, um tubo grosso de curto (cerca de 2 cm de comprimento) e com um tubo fino. Certifique-se de que a banheira finae é longo o suficiente para cobrir a distância entre a bomba de seringa e a platina do microscópio.
- Colocar a seringa na bomba de seringa, o avanço rápido da bomba até que o tubo fino é completamente cheia com o fluido.
- Empurrar o tubo fino ligada à seringa para dentro do canal de entrada do chip e deixar que o fluxo médio através do chip a 10 ul / min (Figura 2B). Recolher o substrato, deixando o chip (por exemplo, numa placa de Petri). O meio vai correr para fora através do canal lateral devido à diferença de resistência entre o resistente-Tag feita grande canal lateral e o canal de saída.
- Colocar o chip na platina do microscópio e ajustar o foco do microscópio sobre as almofadas.
O uso de objetivos de imersão em óleo é preferível que os objectivos de imersão em água porque o óleo não vai secar ao longo do tempo-curso do experimento.
Dependendo do microscópio poderia haver problemas relacionados com a retenção de fOCO durante as horas iniciais do experimento. Por isso, é aconselhável deixar o chip de uma a duas horas no palco microscópio para que ele possa se acalmar antes de células de carga e do início do experimento.
4. Carregamento de células de levedura na Microfluidic Chip
- Ligação a 5 ml Luer seringa para um esboço Luer Calibre 20 e um tubo de espessura (cerca de 3 cm).
- Tomar uma amostra da cultura de células a ser carregado para o chip.
A contagem de células preferido para a carga é de 1-5 x 10 6 culas por ml. As culturas com as contagens mais elevadas de células precisa de ser diluído antes do carregamento. Quando a cultura de células em meio YPD, a eficiência de carregamento de células pode ser melhorada muitas vezes se as células são lavadas primeiro com e ressuspensas em meio mínimo contendo uma percentagem de glucose semelhante antes do carregamento. Durante o funcionamento do chip, meio YPD novamente pode ser usado com segurança.
- Carregar cerca de 1 ml de suspensão de células em the seringa e remover todo o ar da seringa.
- Diminuição da taxa de fluxo da bomba de seringa a 0,5 ul / min. O baixo fluxo contínuo e reforçado pela bomba de seringa durante a carga (no passo 4.5) vai empurrar as células não-inscritos para fora através do canal lateral (Figura 2C).
- Ligação a seringa que contém a suspensão de célula para o tubo do canal de saída. Carregar as células pressionando o êmbolo da seringa gentilmente. Observe as células que entram e liquidação debaixo das micropads via ocular ou via tela do computador.
- Manter a pressão sobre o êmbolo até que as células suficientes resolver debaixo das almofadas. A carga máxima é 1-3 células por pad. Como as células se contentar debaixo das almofadas de forma aleatória, é bastante comum que algumas pastilhas não contêm células e outras almofadas são completamente preenchida com células.
- Desligue a seringa usada para o carregamento da célula eo tubo grosso ligado a ela do tubo fino do canal de saída, lave o ch ladoAnnel para um par de minutos a taxas de fluxo mais elevadas (10 ul / min) para remover as bolhas de ar e / ou células que ainda não saiu do chip (Figura 2B). Se as células não são removidos do canal lateral, elas podem começar a crescer no canal lateral e interferir com a experiência mais tarde.
- Coloque o fluxo da bomba de seringa, de volta para baixo para 0,5 ul / min e fechar o canal lateral para fora, ligando-o a um tubo de espessura (cerca de 5 cm de comprimento), que contém um tampão de cateter, na sua extremidade (figura 2D).
- Aumenta o fluxo a uma taxa de fluxo final 1-5 ul / min. As taxas de fluxo podem variar dependendo do meio e a estirpe de levedura.
- Iniciar um filme com as configurações de microscópio e câmera adequada para o objetivo do experimento. Certifique-se de que a velocidade da platina do microscópio está configurado para uma velocidade tão baixa que o óleo pode seguir. Para a determinação do tempo de vida replicativo, as células da imagem a cada 10 min. Para proteger as células a partir das quantidades diminutas de luz UV emitida pela halogéneolâmpada, que é utilizado durante a aquisição de DIC, é aconselhável colocar um filtro UV adicional no caminho da luz. Ao usar a microscopia de fluorescência, é preferido que as células da imagem com menor frequência (por exemplo, a cada 20 minutos), para evitar os efeitos fototóxicos. O ensaio é concluído quando todas as células carregadas no início da experiência são mortos, o que em condições normais de demora até 5 dias. Recomenda-se verificar regularmente o foco das imagens durante o experimento e, se necessário ajustá-lo.
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Resultados
Neste protocolo, as células são carregadas para o chip de microfluidos directamente da cultura de meio-exponencial. Para determinar se a distribuição da idade das células aprisionadas no chip microfluídico é semelhante à da cultura antes do carregamento, as células foram coradas com aglutinina de trigo conjugada com FITC (WGA-FITC) para visualizar cicatrizes bud. Como pode ser visto na Figura 3, o aprisionamento de células sob as micropads do chip de microfluidos não é enviesada para as células de uma d...
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Discussão
O método de microfluídica aqui descrito é uma nova ferramenta importante na pesquisa do envelhecimento, uma vez que permite a geração simples e automatizado de dados expectativa de vida replicativo fermento em combinação com imagens de alta resolução contínua. Estes atributos são importantes melhoramentos em relação às possibilidades experimentais do método de dissecação clássico, ainda existem algumas limitações do método, que devem ser tidos em conta.
Note-se que o tempo de vida replicativ...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Laura Schippers para escrever as primeiras versões do protocolo de carga celular e Marcus de Goffau e Guille Zampar por atingir morfologias mitocondriais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Elastômero Sylgard 184 | Mavom bv | 1060040 | Este pacote contém base PDMS e agente de cura PDMS. |
| Placas de Petri de vidro 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Vidros de cobertura 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Folha | |||
| Copo | |||
| Pipeta serológica 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Fita adesiva | VWR International | 819-1460 | |
| Pasta Baysilone (silicones GE Bayer) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| Tubulação microbore PTFE, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referido como tubulação fina |
| Tubulação microbore Tygon, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referido como bisturi de tubo espesso |
| VWR International | 233-5334 | ||
| Seringas Luer-Lok de 50 ml | BD | 300137 | |
| seringas de 5 ml, ponta Luer | VWR International | 613-1599 | |
| Pinças | VWR International | 232-2132 | |
| Calibre 20 Pontas Luer | Instech Solomon | LS20 | |
| Filtros de seringa (tamanho do poro 0,20 μ m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Plugue de cateter de aço inoxidável, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Placas de Petri | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Limpador de ozônio UV de bancada | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| molde mestre do silicone SU-8 (bolach) | Auto-feito; Para obter detalhes, entre em contato com o autor correspondente | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Bomba de vácuo | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Dessecador | VWR International | 467-2115 | |
| Placa quente | VWR International | 460-3267 | |
| Opcional: Suporte de metal para vidro de cobertura (22x40 mm) | Feito por si mesmo; Para obter detalhes, entre em contato com o autor correspondente | ||
| (Fluorescência) Microscópio com objetiva de 60x, foco automático, habilidades de lapso de tempo e, de preferência, um estágio automatizado (controle XY motorizado) | Nikon | Eclipse Ti-E |
Referências
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
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Reimpressões e permissões
