Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

Summary

Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.

Abstract

Nós demonstramos a utilização de uma configuração de microfluidos simples, no qual as células de levedura de brotamento individuais podem ser rastreados em todo o seu tempo de vida. O chip de microfluídica explora a diferença de tamanho entre as células mãe e filha usando uma matriz de micropads. Após a carga, as células são presos debaixo destas micropads, porque a distância entre o microPad e tampa de vidro é semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura (3-4 mm). Após o procedimento de carregamento, meio de cultura é continuamente perfundido através do chip, o que não só cria um ambiente constante e definida ao longo de toda a experiência, mas também elimina as células filhas emergentes, que não são retidas por baixo das almofadas, devido ao seu menor tamanho. A configuração retém células mãe tão eficientemente que numa única experiência de até 50 células individuais podem ser monitorizados de um modo totalmente automático, durante 5 dias, ou, se necessário, mais longo. Além disso, as propriedades ópticas excelentes do chip permitir altaResolução de imagem de células durante todo o processo de envelhecimento.

Introduction

Brotação de levedura é um organismo modelo importante para o envelhecimento investigação ^1. Até recentemente, o estudo de envelhecimento replicativo em células de levedura era um processo laborioso que requer um método de esvaziamento, em que cada botão era removido manualmente a partir da célula mãe ^2,3. Para resolver este problema, que recentemente apresentou um novo configuração microfluídicos capaz de rastrear células mãe individuais ao longo de toda sua vida útil ^4.

Em nosso chip de microfluídica, células de levedura são presos sob micropads suaves à base de elastómeros (ver Figura 1).

Protocol

1. Produção e Elaboração de um Wafer molde de silicone

Chips microfluídicos são criados a partir de um molde de wafer de silício produzidos por litografia macia. Essas pastilhas podem ser reutilizadas muitas vezes para produzir chips microfluidicos. É aconselhável que a produção de um respectivo bolacha é realizada por um grupo especializado em microfluidos ^6.

A bolacha é feito num processo de duas etapas de fotolitografia usando duas camadas diferentes de material fotosensitivo negativo, SU-8 ^7. A camada inferior é usada para gerar a área de captura da célula (SU-8 2002; altura de 3-4 mm),....

Results

Neste protocolo, as células são carregadas para o chip de microfluidos directamente da cultura de meio-exponencial. Para determinar se a distribuição da idade das células aprisionadas no chip microfluídico é semelhante à da cultura antes do carregamento, as células foram coradas com aglutinina de trigo conjugada com FITC (WGA-FITC) para visualizar cicatrizes bud. Como pode ser visto na Figura 3, o aprisionamento de células sob as micropads do chip de microfluidos não é enviesada para as células de uma d.......

Discussion

O método de microfluídica aqui descrito é uma nova ferramenta importante na pesquisa do envelhecimento, uma vez que permite a geração simples e automatizado de dados expectativa de vida replicativo fermento em combinação com imagens de alta resolução contínua. Estes atributos são importantes melhoramentos em relação às possibilidades experimentais do método de dissecação clássico, ainda existem algumas limitações do método, que devem ser tidos em conta.

Note-se que o tempo de vida replicativ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DC Elastômero Sylgard 184	Mavom bv	1060040	Este pacote contém base PDMS e agente de cura PDMS.
Placas de Petri de vidro 120/20 mm	VWR International	391-2850
Vidros de cobertura 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
Folha
Copo
Pipeta serológica 5 ml	VWR International	612-1245
Fita adesiva	VWR International	819-1460
Pasta Baysilone (silicones GE Bayer)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
Tubulação microbore PTFE, 0.012"ID x 0.030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Referido como tubulação fina
Tubulação microbore Tygon, 0.030"ID x 0.090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Referido como bisturi de tubo espesso
	VWR International	233-5334
Seringas Luer-Lok de 50 ml	BD	300137
seringas de 5 ml, ponta Luer	VWR International	613-1599
Pinças	VWR International	232-2132
Calibre 20 Pontas Luer	Instech Solomon	LS20
Filtros de seringa (tamanho do poro 0,20 μ m)	Sigma-Aldrich	16534K
Plugue de cateter de aço inoxidável, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Placas de Petri	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
Limpador de ozônio UV de bancada	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
molde mestre do silicone SU-8 (bolach)			Auto-feito; Para obter detalhes, entre em contato com o autor correspondente
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Bomba de vácuo	KNF Neuberger	N022 AN.18
Dessecador	VWR International	467-2115
Placa quente	VWR International	460-3267
Opcional: Suporte de metal para vidro de cobertura (22x40 mm)			Feito por si mesmo; Para obter detalhes, entre em contato com o autor correspondente
(Fluorescência) Microscópio com objetiva de 60x, foco automático, habilidades de lapso de tempo e, de preferência, um estágio automatizado (controle XY motorizado)	Nikon	Eclipse Ti-E